Biochemiepraktikum

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Biochemie Praktikum: Proteinchemie
Durchführung:
Man bereitet ein 0,5 % iges Agarosegel, indem man 0,5 g Agarose in 100 ml 0,67 mM PO 4 -
Puffer pH 7,2 unter kräftigem Rühren auf dem Magnetrührer zum Sieden erhitzt. Danach lässt
man auf 45° - 50° C abkühlen (Wichtig: Bei zu hoher Temperatur wird das Tetrazoliumsalz
reduziert).
In 100 ml dieser Lösung (45 - 50° warm!) werden
20 mg NAD +
50 mg Tetrazoliumsalz (MTT)
2g Lithium-Lactat (möglichst verrieben) und
einige Körnchen Phenacinmethosulfat
gelöst. Auf Glasplatten verteilt man je 50ml dieser Mischung und lässt sie erstarren. Diese
Färbegele sind vor Beendigung der Elektrophorese herzustellen und bis zum Gebrauch vor
Licht geschützt aufzubewahren! Nach Beendigung der Elektrophorese werden die Folien mit
der Auftragseite nach unten sofort nach Abschalten des Stromes und Entnahme der Streifen
luftblasenfrei aufgelegt. Vor Licht geschützt inkubiert man, bis die Enzymbanden als
blauviolette Streifen sichtbar werden. Die Membranen werden von den Färbegelen abgelöst,
überschüssiges Reagenz durch Waschen in Wasser entfernt. Anschließend werden die Folien
zwischen Filterpapier getrocknet.