Biochemiepraktikum

Phenol/Chloroform:
25 Teile TE-gesättigtes Phenol
24 Teile Chloroform
1 Teil Isoamylalkohol
TE (steril!): 10 mM Tris/HCl, pH 7,5
"Alkali-Minipräp"
1 mM EDTA
Alle E. coli-Reste (Spitzen, Zellstoff, Überstände...) zur Vernichtung sammeln!
- Je 2 Eppendorf-Gefäße mit E. coli-Kulturen füllen (1,5 ml)
- ca. 1 min zentrifugieren, Überstände in ein Sammelgefäß gießen und
Eppendorf-Gefäße mit der Öffnung nach unten auf Zellstoff abtropfen lassen
- Zellsediment in 150 µl Lösung I resuspendieren
- 300 µl Lösung II zugeben und Eppendorf-Gefäße durch Schütteln gut mischen!
- 2 min bei Raumtemperatur inkubieren (Zeit genau einhalten!!!!)
- zügig 450 µl eiskalte Lösung III zugeben und vorsichtig mischen
(Eppendorf-Gefäße mehrmals wenden), 10 min auf Eis stellen
- 5 min abzentrifugieren und 500 µl Überstand in frisches Eppendorf-Gefäß überführen
ab jetzt Handschuhe tragen! Phenolabfälle getrennt sammeln!
- 500 µl Phenol/Chloroform zugeben, 1 min vortexen
- 2 min zentrifugieren, obere, wässrige Phase vorsichtig abnehmen und
in ein frisches Eppendorf-Gefäß überführen
- 500 µl reines Chloroform zugeben, 1 min vortexen
- 1 min zentrifugieren
- 400 µl der oberen Phase in ein frisches Eppendorf-Gefäß überführen
- 400 µl Isopropanol zugeben, mischen
- ca. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren
- 10 min zentrifugieren, dabei auf die Orientierung der Eppendorf-Gefäßes achten!!!!!
- Überstand mit ausgezogener Pasteurpipette abnehmen
- Pellet mit 300 µl 70% Ethanol waschen, vorsichtig zugeben,
nicht schütteln da sich sonst die DNA ablöst und abgezogen wird
- 1 min zentrifugieren (gleiche Orientierung wie oben)
und den Überstand mit einer ausgezogenen Pasteurpipette möglichst vollständig
abnehmen
- Pellet 10 min bei geöffnetem Eppendorf-Gefäß trocknen lassen
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