Biochemiepraktikum

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Biochemie Praktikum: Proteinchemie
- Die LDH-Proben auf eine Konzentration von 1µg/µl verdünnen. Von
dieser Verdünnung werden 12µl in ein neues Eppendorf-Gefäß
überführt und 4µl Probenpuffer zugegeben.
- Proben vor dem Auftragen 3 min bei 90 ° C denaturieren, anschließend
2 min bei 13000rpm zentrifugieren.
b. Auftragen der Proben und des Proteinstandards:
3 µl Proteinstandard in die erste Geltasche einfüllen, in die folgenden
Taschen die vorbereiteten Proben geben.
8. Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung von 150 V starten (Polung beachten).
9. Die Elektrophorese ist beendet, wenn die Bromphenolblau-Bande das untere Ende des
Gels erreicht hat (ca. 1.5 h).
10. Das Gel wird aus der Kammer genommen und die Laufstrecke der Bromphenolblaubande
bestimmt. Danach wird das Gel mit einer Coomassie-Brillantblue Lösung
gefärbt. Nach Entfernen überschüssigen Farbstoffs durch mehrmaliges Waschen des
Gels mit 10% iger Essigsäure werden die Proteinbanden sichtbar.
11. Anschließend werden die Laufstrecken der einzelnen Proteinbanden (LDH-Proben und
Markerproteine) bestimmt.
Die relative Beweglichkeit eines jeden Proteins wird nach folgender Gleichung
errechnet.
Beweglichkeit=
Laufstrecke-Protein
Laufstrecke-Bromphenolblau
13. Die relativen Beweglichkeiten der Markerproteine werden gegen den Logarithmus
ihrer Molekulargewichte aufgetragen. Aus der Beweglichkeit der LDH kann dann
anhand der ermittelten Eichgerade das Molekulargewicht einer LDH-Untereinheit
bestimmt werden.