Biochemiepraktikum

Der Ansatz wird mit 72 µl Verdünnungspuffer (Puffer 2) auf das siebenfache Volumen
verdünnt.
Verdünnungspuffer: 0.25 M Natriumphosphat pH 7,5
10 mM EDTA
10 mM ß-Mercaptoethanol
0,75 % Triton X100
- 12 µl Probe werden entnommen und in einem beschrifteten Eppendorfhütchen mit 12 µl
2xProbenpuffer gemischt, 5 min auf 95°C erhitzt und anschließend auf Eis gestellt.
- Der restliche Ansatz wird nach dem Abkühlen der Probe mit 1 µl N-Glykosidase F versetzt
(Achtung: Immer eine frische Pipettenspitze benutzen!) und bei 37°C im Heizblock inkubiert.
- Nach 1, 5, 15, und 60 min werden jeweils 12 µl Probe entnommen und entsprechend der
ersten Probenentnahme behandelt. Durch Zugabe des SDS-Probenpuffers wird die
enzymatische Reaktion gestoppt.
- Alle für die SDS-Gelelektrophorese vorbereiteten Proben werden bis zur Elektrophorese auf
Eis aufbewahrt.
- Elektrophorese-Durchführung siehe 3. Tag !
11. Tag
A) Immundetektion der deglykosylierten CPY siehe 4. Tag !
B) Ansetzen von Kulturen für kinetische CPY-Aktivitätsmessungen
20-ml-Kulturen (Mineralmedium !) müssen mit den drei auf der folgenden Seite
beschriebenen Hefestämmen beimpft und über Nacht bei 30°C geschüttelt werden.
36