Biochemiepraktikum

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Biochemie Praktikum: Proteinchemie
man in Säugetieren zwei verschiedene für LDH-Untereinheiten kodierende Gene findet.
Native LDH ist ein oligomerer Enzymkomplex aus vier Untereinheiten. Die zwei
unterschiedlichen Untereinheiten, die H-Form (findet man hauptsächlich im Herzmuskel) und
die M-Form (findet man hauptsächlich im Skelettmuskel) können zu fünf verschiedenen
Isoenzymkomplexen kombiniert werden.
H
H
H
H
H
H
M
H
H
M
M
H
H
M
M
M
M
M
M
M
Die H-Untereinheit besitzt einen isolelektrischen Punkt von 4.5, die M-Untereinheit von 9.0.
Arbeitet man nun in einem Puffersystem mit einem pH-Wert von ca. 9, liegt die H-Form
deprotoniert, d.h. als Anion vor, während die M-Form praktisch ungeladen ist. Daraus folgt
für die verschiedenen Isoenzymformen:
Die am schnellsten zur Anode wandernde Komponente ist die reine H 4
-Form, während die
reine Skelettmuskelform M 4
an der Auftragungsstelle liegenbleibt oder geringfügig zur
Kathode wandert; die anderen Hybridformen wandern mit zunehmendem Anteil an H-
Untereinheiten schneller in Richtung Anode. Elektrophorese von Isoenzymgemischen aus
verschiedenen Organen kann man nutzen, um den unterschiedlichen Gehalt der LHD-
Isoenzymformen in diesen Geweben nachzuweisen.
Arbeitsgang zur Trennung der LDH-Isoenzyme
Man bereitet 1 Liter 0,03 M Barbitalpuffer vom pH-Wert 8,6 (dazu wird die berechnete
Menge Barbital-Natrium in ca. 900 ml Aqua dest. gelöst, man stellt den pH-Wert mit 2 N HCl
auf 8,6 und füllt mit H 2 0 auf 1 Liter auf). Die Elektrodenräume der Elektrophoresekammer
werden mit 400 ml Puffer gefüllt. Die Folien können im trockenen Zustand mit
Kugelschreiber beschriftet werden. Zum Einweichen werden die Acetatfolien vorsichtig auf
die Oberfläche des Puffers gelegt und erst wenn sie die Lösung vollständig aufgesaugt
haben, untergetaucht. Nach etwa 15 min. werden die Folien aus der Lösung herausgenommen
und mit der Pinzette in die Streifenträger so eingesetzt, dass die Stifte in die
Perforationslöcher greifen. Danach werden die Rahmen in die Elektrophoresekammer gesetzt.
Die Streifenenden müssen in die Pufferlösungen eintauchen. Dieser Arbeitsgang muss schnell
durchgeführt werden und zwischendurch die Pufferkammer immer geschlossen werden, damit
die Folien nicht austrocknen (zeigt sich durch das Auftreten heller, weißer Flecken).
Überschüssiger Puffer auf den Folien wird mit Zellstoff abgetupft und die Folien etwa zehn
Minuten in der Kammer äquilibriert. Vor Auftragen der Proteinproben dürfen keine "Pfützen"
auf den Folien mehr sichtbar sein.
Von den zu untersuchenden Proteinlösungen wird jeweils ein Tropfen in die Aussparungen
der Serumpalette pipettiert. Durch vorsichtiges Berühren der Tropfenoberfläche mit dem
Auftragestempel wird eine geringe, durch die Stempelgröße definierte Menge der Lösung
aufgenommen und auf die Folie durch einfaches Niederdrücken der Taste (ca. 1 sec lang)