Biochemiepraktikum

Die Filter werden mit Bleistift markiert und mit einer Pinzette für etwa 10 Sekunden in
flüssigen Stickstoff getaucht, um die Hefezellen zu permeabilisieren. Den gefrorenen Filter
legt man dann auf einen zweiten Filter, welcher mit 2,5 ml Z-Puffer mit X-Gal getränkt ist.
Nach 1- 3 Stunden Inkubation bei 30°C zeigt eine intensive Blaufärbung eine Protein-
Proteinwechselwirkung an.
Z-Puffer:
Für 2,5 ml Lösung:
Na 2 HPO 4 .7H 2 0 16,1 g/l 6,75 µl β-Mercaptoethanol
NaH 2 PO 4 .H 2 0 5.5 g/l 25 µl 2% ige X-Gal-Lösung in DMF
KCl 0,75 g/l Z-Puffer ad 2,5 ml
MgSO 4 .7H 2 O 0,25 g/l
B) Animpfen von Flüssigkulturen mit E. coli Transformanten-Kolonien
Nach dem Auszählen der in den beiden Ansätzen erzielten Transformanten-Kolonien sollen
von jedem Hefe-DNA-Transformationsansatz 2 LB-Amp Flüssigkulturen von 2 ml beimpft
werden. E. coli Kulturen mit Referenzplasmiden (Ausgangsplasmid p13-up/down und mit
CIC1 „aufgefülltes“ Plasmid p13-gap) werden ebenfalls angesetzt.
- Zum Animpfen mit der spitzen Seite eines sterilen Zahnstochers vorsichtig in eine
Einzelkolonie stechen und den Zahnstocher ins Kulturgläschen fallen lassen
- Inkubation der Kulturen im Schüttler bei 37 °C über Nacht
C) Anlegen von "patches" der 5-FOA-resistenten Klone
Für den abschließenden CPY-Enzymtest werden 5-FOA-resistente Einzelkolonien auf
frischen MV-5-FOA Platten als "patches" vermehrt. Dafür werden aus 3-4 "streaks" insgesamt
mindestens 12 Einzelkolonien ausgewählt. Als Kontrollen werden auch "patches" von Uracilauxotrophen
Wildtyp- und CPY-Mutantenstämmen angelegt. (5-FOA ist sehr teuer, daher
jeweils 1 Platte unter 2 Gruppen aufteilen!)
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