Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Material und Methoden
3.5.1 Teilstudie I – Messung von Thrombozytenaktivität und -reaktivität
Im Mittelpunkt der ersten Teilstudie stand der Aufbau und die Weiterentwicklung einer
eigenständigen Methodik zur Untersuchung der Thrombozytenaktivität und –reaktivität. Alle
Messungen wurden jeweils nach der Methode der direkten Immunfluoreszenzmarkierung in
Doppelfärbung mit CD41/CD62P bzw. CD42b/PAC-1 aus dem Vollblut durchgeführt. Dabei
wurden die plättchenspezifischen, monoklonalen Antikörper CD41 (GP IIbIIIa, Fibrinogenrezeptor)
und CD42b (GP Ib-V-IX, von-Willebrand-Faktor Rezeptor) jeweils als Farbstoffkonjugate
mit Phycoerythrin (PE, Emissionswellenlänge 568-590 nm) eingesetzt und dienten
als Detektionsmarker zum Auffinden der Thrombozyten im Vollblut. Die Antikörper gegen
die aktivierungsabhängigen Antigene P-Selektin (CD62P) und PAC-1 wurden jeweils als
Farbstoffkonjugate mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC, Emissionswellenlänge 504-541 nm)
verwendet. Zur Untersuchung der Thombozytenreaktivität wurden Stimulationsversuche mit
ADP und TRAP-6 in unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt. Den Empfehlungen
der Literatur (157, 170, 226, 279, 302) folgend wurden die Proben nach Abschluss der
Antikörperinkubation fixiert (nachträgliche Fixierung). Um den Einfluss der Fixierung auf
das Messergebnis zu untersuchen, erfolgten darüber hinaus auch Messungen ohne Fixierung
(unfixiert) sowie von Proben, die zunächst fixiert und erst anschließend gefärbt wurden
(direkte Fixierung). Während die Messung der nachträglich fixierten Proben in einem festen
Ablauf über die gesamte Studie konstant durchgehalten wurde, konnten die Untersuchungen
zum Einfluss der unterschiedlichen Fixierung aus Kapazitätsgründen nur an einzelnen
Interventionstagen durchgeführt werden.
Mit der Probenaufbereitung für die Durchflusszytometrie wurde binnen 5 Minuten nach der
Blutabnahme begonnen. Nach der Bestimmung der Thrombozytenzahl im Blutbildautomaten
erfolgte zunächst eine Einstellung der Vollblutprobe auf eine konstante Zellzahl von 20000
Thrombozyten/μl. Dazu wurden jeweils 100 μl des mit Na-Citrat antikoagulierten Vollbluts
(2,9 ml Monovette) mit der entsprechenden Menge eines auf 37 °C vorgewärmten PBS-
Puffers (pH 7,4; Life Technologies, Gibco-BRL, Karlsruhe - Germany) einschließlich 0,5 %
bovinem Serumalbumin (BSA, Vitros Ortho-Clinical Diagnostics, Neckargemünd - Germany)
verdünnt. Mit Ausnahme der direkten Fixierung (s.u.) gingen alle weiteren Ansätze von dieser
Probenlösung aus. Um die artifizielle Aktivierung der Thrombozyten in vitro möglichst
gering zu halten, wurde keine der Proben während der Probenaufbereitung geschüttelt oder
gevortext. Eine ausreichende Durchmischung wurde allein durch wiederholtes sanftes
Aufziehen in eine 1 ml Pipettenspitze erreicht.
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