Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Material und Methoden
Die Auswertung der Aktivität für CD62P-FITC kann prinzipiell ebenfalls durch die
Berechung der MFI für FITC erfolgen. Im Gegensatz zur CD41-PE Messung (s.o.) reagieren
jedoch nicht alle Thrombozyten nach Stimulation einheitlich mit einer erhöhten Expression
des CD62P-Antigens (Abb 12b). Hier bietet sich zusätzlich eine Auswertung nach Prozent
positiven Zellen an (15, 268, 270, 297). Dazu wird in einer Negativkontrolle die Eigen-
fluoreszenz und die unspezifische Bindung von CD62P-Antikörpern an Thrombozyten bestimmt
(Abb. 12a). Anhand dieser Kontrolle wird dann ein Schwellenwert als Cut-off Linie
definiert, der etwa 0,5 bis 1% positive Zellen als Leerwert abgrenzt. Die Festlegung des
Grenzwertes auf 0,5 bis 1 % folgt der allgemeinen Konvention und ergibt sich aus dem
statistischen Verteilungsmuster und dem Auflösungsvermögen der Durchflusszytometrie. Alle
Ereignisse, die sich während der Messung der spezifisch gefärbten Thrombozyten oberhalb
des Grenzwertes verteilen, gelten als positive Zellen (Abb. 12b). Da CD62P nur auf der
Oberfläche von aktivierten Thrombozyten nachweisbar ist, entspricht die Auswertung nach
Prozent positiven Zellen dem Anteil an aktivierten Thrombozyten in der untersuchten Probe.
Die Auswertung der Immunfluoreszenzmarkierung mit CD42b-PE und PAC-1-FITC erfolgte
analog dem oben beschriebenen Vorgehen.
CD62P [log]
CD62P [log]
Abbildung 12: Auswertung nach % positiven Zellen für CD62P-FITC am Beispiel 10µM TRAP-6 stimulierter
Thrombozyten (b) nach Festlegung eines Schwellenwerts in der Negativkontrolle (a)
In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass in die Gate B gefassten und zur weiteren
Auswertung herangezogenen Ereignisse eine Reinheit von > 98% Thrombozyten aufweisen.
Zur Kontrolle der Reliabilität der Methode wurden vor Studienbeginn jeweils die Intra- und
Intertest Variationskoeffizienten für die einzelnen Probenansätze bestimmt. Die Bestimmung
der Intratestvariabilität erfolgte durch die 10-malige Messung der gleichen Probe. Für die
Intertestvariabilität wurden jeweils 10 identische Proben pipettiert und anschließend
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