Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Diskussion
der Zirkulation bei cardiochirurgischen Eingriffen zusätzlich durch die Adhäsion an die
Fremdoberfläche des extrakorporalen Kreislaufs verursacht (105, 334).
Eine alternative Möglichkeit für den Verbleib aktivierter Thrombozyten in der Zirkulation
ergibt sich durch die Oberflächenexpression von P-Selektin und die daraus resultierende
Adhäsion an zirkulierende Leukozyten (119, 189). Diese Thrombozyten-Leukozyten Konju-
gate verbleiben länger in der Zirkulation als aktivierte Thrombozyten und wurden als sensiti-
ver Marker einer Thrombozytenaktivierung in vivo beschrieben (228). Eine solche Bildung
von Konjugaten findet sich unter anderem während cardiochirurgischer Eingriffe (276), bei
einem Myocardinfarkt (95) oder einer koronaren Herzkrankheit (94, 102) und soll mit einem
erhöhten Rezidivrisiko nach koronarer Katheterintervention einhergehen (229).
In diesem Zusammenhang muss auch angefügt werden, dass RINDER et al. nach einer
intensiven in vitro Stimulation von Vollblut mit Thrombin zunächst einen raschen Anstieg
von CD62P positiven Thrombozyten fanden. Ihre Zahl war jedoch innerhalb von wenigen
Minuten nach Stimulationsbeginn bereits wieder rückläufig, da es durch eine zunehmende
Konjugatbildung zu einem Verbrauch singulärer aktivierter Thrombozyten kam (277).
5.4 Thrombozyten-Leukozyten Konjugate – methodische Aspekte
Vor diesem Hintergrund rückte im weiteren Studienverlauf der Aufbau einer Methodik zur
Analyse von Konjugaten immer weiter in Blickfeld der Untersuchung. In enger Anlehnung an
die Methodik zur Funktionsdiagnostik der Thrombozyten wurden alle Schritte der Probenaufbereitung
so gewählt, dass eine artifizielle Aktivierung der Proben in vitro auf ein Minimum
reduziert wird. Auf ein Schütteln oder Vortexen der Proben wurde ebenso verzichtet wie auf
jegliche Zentrifugation oder ein Waschen der Zellen. Die Analyse aus dem Vollblut garantiert
die Untersuchung der gesamten Zellpopulation ohne weiteren Zellverlust. So ergaben Untersuchungen
von LI. et al einen Verlust von durchschnittlich 30 % der Leukozyten nach einem
Waschen der Proben (195). Die Auswahl von Citrat als Antikoagulanz beruhte auf der Erfahrung,
dass für Citrat kaum Einflüsse auf die Ausbildung von Zell-Zell Kontakten bekannt
sind, während EDTA durch eine stärkere Komplexbindung für die Untersuchung von
Zellkonjugaten ungeeignet ist (117).
Die Probenaufbereitung wurde jeweils binnen 5 Minuten nach Blutentnahme begonnen. Nach
Vorwärmen des PBS-Puffers auf 37 °C Körpertemperatur erfolgte zunächst eine Verdünnung
des Vollblutes im Verhältnis 1:4 als Ausgangslösung für die weiteren Untersuchungen. Durch
die Verdünnung wird die Wahrscheinlichkeit für das nachträgliche Auftreten von Zell-Zell
Interaktionen vermindert und so der Bildung von Konjugaten ex vivo vorgebeugt (226). Die
Verdünnung im Verhältnis von 1:4 richtete sich nach dem von FURMAN et al. beschriebenen
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