Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Material und Methoden
Die Probenaufbereitung zur differenzierten Messung von Thrombozyten-Leukozyten
Konjugaten wurde wiederum innerhalb von 5 Minuten nach Blutabnahme begonnen. Auch
die Untersuchung der Konjugatbildung erfolgte in Analogie zu dem für den Dauertest
beschriebenen Vorgehen durch direkte Immunfluoreszenzmarkierung mit CD41-PE und
CD45-PC5. Zur weiteren immunologischen Differenzierung der Leukozyten wurde zusätzlich
ein mit Phycoerythrin-Texas Red®-x (ECD, Wellenlänge 610-635 nm) konjugierter mono-
klonaler CD14 Antikörper (Klon RM052; IgG2a mouse, Coulter-Immunotech Diagnostics)
eingeführt und so die Methodik auf eine 3-Farbenanalyse erweitert. Nach Herstellerangaben
besitzt das CD14 Antigen eine sehr starke Expression auf Monozyten, ist auf Granulozyten
sehr viel schwächer exprimiert und fehlt auf Zellen der lymphozytären Reihe. In
Vorversuchen zeigte sich, dass mit einer Antikörpermenge von 6 µl eine ausreichend
sättigende Konzentration erreicht wird. Nach Zugabe der Antikörper wurden die Proben für
10 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubiert und anschließend die Färbung mit 2 ml PBS
Puffer einschließlich 1 % (w/v) BSA bei 4 °C gestoppt. Alle Proben wurden bis zur Messung
innerhalb von 5-10 Minuten im Dunkeln und auf Eiswasser gelagert und nicht fixiert.
Zur Untersuchung der Proben auf ihre zeitliche Stabilität wurden für 5 Probanden die Proben
nach der eigentlichen Messung in das Eiswasser zurückgestellt und weiterhin bei Dunkelheit
gelagert. Erneute Messungen erfolgte dann jeweils nach 15, 30 und 60 Minuten.
Alle Messungen wurden erneut an einem EPICS ® XL/MCL TM 4-Color Durchflusszytometer
durchgeführt. Die Messbereiche für die Immunfluoreszenzfarbstoffe lagen bei 525-550 nm für
FITC, bei 575-600 nm für PE, bei 610-625 nm für ECD und bei 645-675 nm für PC-5.
Automatische Stoppkriterien wurden bei 10000 Thrombozyten bzw. 1000 Monozyten mit einer
kontrollierten Flussrate von ca. 200 Ereignissen pro Sekunde eingesetzt. Alle Messungen
waren innerhalb von 30 Minuten nach Blutentnahme abgeschlossen. Zur Qualitätssicherung
erfolgte die tägliche Kontrolle der Zytometereinstellungen und der Laserleistung mit Hilfe
von Flow-Check Fluorespheres ® und der System II TM Software.
Die Auswertung der Thrombozytenaktivität- und reaktivität für CD62P und CD63 wurde
analog der bereits beschriebenen Methode nach % positive Zellen auf der Grundlage des in
der Isotyp-Kontrolle festgelegten Grenzwertes durchgeführt. Für die Angabe des Anteils
positiver Zellen wurden die Werte der Isotyp-Kontrolle wiederum als Leerwerte abgezogen.
Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für CD41-PE diente als Maß für Veränderungen der
Expression von CD41 auf der Thrombozytenoberfläche. Für die Auswertung der
Thrombozyten-Leukozyten Konjugate erfolgte zunächst das Gating der Leukozyten aus dem
Vollblut auf der Grundlage ihrer Färbung mit CD45-PC5 und ihrer Seitwärtsstreulicht-
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