Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Material und Methoden
Zu Beginn jedes Untersuchungstages erfolgten standardisiert die Justierung der Einstellungen
am Durchflusszytometer mit Hilfe von Flow-Set Fluorespheres ® (Beckman Coulter) und der
System II TM Software. Anhand von anschließenden Kontrollmessungen mit Flow-Check
Fluorespheres ® (Beckman Coulter) wurden die optischen Eigenschaften und Verstärker-
einstellungen nochmals kontrolliert.
Die Auswertung mit der System II TM Software (Beckman Coulter) wird hier am Beispiel der
Immunfluoreszenzmarkierung mit CD41/CD62P demonstriert. Die Identifizierung der
Thrombozyten im Vollblut erfolgte anhand der zweidimensionalen Punktdarstellung in der
Aufteilung nach Vorwärtsstreulicht (Abszisse) und der Fluoreszenzintensität für den
Phycoerythrin (PE) konjugierten monoklonalen CD41 Antikörper. Jeder der in Abbildung 9
wiedergegebenen Punkte entspricht einem durchflusszytometrischen Messereignis. Dabei
sammeln sich die Messereignisse für gleiche Zellarten zu Wolken, deren Dichte die
Häufigkeit der entsprechenden Zellpopulation wiedergibt. In der wiedergegebenen Graphik
sind die Thrombozyten mit (a) gekennzeichnet. Die mit (b) beschriftete Zellwolke entsteht
durch den gemeinsamen Durchtritt von
Erythrozyten und/oder Leukozyten mit
Thrombozyten durch die Messkammer
des Durchflusszytometers (211). Die Er-
C
D
eignisse besitzen zwar die gleiche CD41-
4
1
PE Intensität, wie einzelne Thrombo-
-
P
zyten, unterscheiden sich von diesen aber
E
durch ein stärkeres FSC.
FSC [log]
Abbildung 9: Detektion der Thrombozyten aus
dem Vollblut. Gating nach FSC vs. CD41-PE
(vgl. Text)
Mit Hilfe eines voreingestellten Schwellenwertes für die Fluoreszenzintensität von PE können
alle Zellen, die nicht das plättchenspezifische CD41-Antigen tragen, ausgeschlossen werden.
Zur Orientierung ist mit (c) die Lage der Erythrozyten und an ihrem rechten Rand auch der
Leukozyten wiedergegeben. Die in jeder Messung zu beobachtenden Zelltrümmer und
sonstigen Fragmente kämen entsprechend ihrer geringen Größe und Fluoreszenzintensität für
CD41-PE im linken unteren Quadranten zum liegen (d). Für die weitere Analyse wurden die
Thrombozyten in (A) markiert und ausgewählt („Gating“).
Die Validierung der in (A) gegateten Thrombozyten erfolgte dann in der Punktdarstellung von
Vorwärts- gegen Seitwärtsstreulicht (Abb. 10). Ereignisse, die in ihren FSC- und SSC-
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