Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Diskussion
flusszytometrische Nachweis des Rückgangs der Oberflächenexpression von GP Ib-V-IX
sowohl von der Art der Fluoreszenzmarkierung (109) als auch vom Zeitpunkt der Antikörper-
inkubation (219) abhängig ist. Wird die Fluoreszenzmarkierung von GP Ib-V-IX erst dann
durchgeführt, wenn die aktivierungsabhängige Umverteilung in das Zellinnere bereits erfolgt
ist, können nur noch die auf der Oberfläche verbliebenen Rezeptoren markiert werden. Da ein
selbständiges Eindringen der Antiköper in das oberflächenverbundene Kanälchensystem nicht
möglich ist, kann mit dieser Methodik die Oberflächenabnahme von GP Ib-V-IX gemessen
werden. Erfolgt die Aktivierung der Thrombozyten jedoch erst nach Zugabe der fluoreszenzmarkierten
Antikörper, so werden die GP Ib-V-IX Rezeptorkomplexe einschließlich der ihnen
bereits anhaftenden Antikörper internalisiert. In diesem Fall ist die Umverteilung von GP Ib-
V-IX nicht messbar, da durchflusszytometrisch nicht zwischen oberflächengebundenem und
internalisiertem Farbstoff unterschieden werden kann.
Betrachtet man die fixierungsabhängigen Einflüsse auf die vier untersuchten Antikörper
zusammenfassend, so wird rasch deutlich, dass die gefundenen Veränderungen nicht allein
über unspezifische Effekte der Fixierung, eine veränderte Autofluoreszenz der Thrombozyten
oder einen fixierungsabhängigen Verlust bestimmter Epitope (297) erklärt werden können. In
Folge der direkten Fixierung der Thrombozyten mit Paraformaldehyd kam es zu einem
Formwandel der Thrombozyten sowie jeweils signifikanten Anstiegen von CD41, CD62P und
PAC-1. Angesichts des gleichzeitigen Rückganges von CD42b muss gefolgert werden, dass
die direkte Fixierung mit Paraformaldehyd eine systematische Aktivierung der Thrombozyten
provoziert. Erfolgt die Fixierung erst nach der Antikörperinkubation treten die beobachteten
Veränderungen in deutlich geringerem Ausmaß zu Tage, bleiben aber mit Ausnahme von
CD42b angesichts der oben diskutierten Ursachen weiterhin nachweisbar.
Unter Verwendung von CD62P als einzigem Aktivierungsmarker wären diese systematischen
Veränderungen leicht übersehen worden. Bei nachträglicher Fixierung zeigte sich sowohl für
ruhende als auch für TRAP-6 stimulierte Thrombozyten kein messbarer Unterschied in der
Expression von CD62P. Auch in der direkten Fixierung wird nur ein geringer Stimulationseffekt
auf CD62P sichtbar, der für die ruhenden Thrombozyten zwar zu einem signifikanten
Anstieg der MFI führt, aber nicht ausreicht, um in der Auswertung nach % positiven Zellen
einen signifikanten Unterschied zu provozieren.
5.2.3 Probenstabilität
Nach einer Fixierung mit Paraformaldehyd und anschließendem Waschen der Thrombozyten
fanden AULT et al., dass die Oberflächenexpression von P-Selectin über 48 Stunden stabili-
siert werden kann (8). Auch an anderer Stelle wird von einer 24-stündigen Stabilität der P-
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