Belastungsinduzierte Veränderungen von Thrombozyten ...

Material und Methoden
Der einzige Unterschied bestand darin, dass zum Abstoppen der Immunfluoreszenzfärbung
jeweils 1 ml PBS-Puffer mit 0,5 % BSA ohne Zugabe von Paraformaldehyd (PFA) verwendet
wurde. Für die direkte Fixierung wurden je 500 μl Na-Citrat antikoaguliertes Vollblut und
500 μl PBS-Puffer mit 0,5 % BSA und 1 % PFA gemischt und für 3 Minuten bei 37 °C
inkubiert. Anschließend wurden 100 μl dieser Lösung entnommen und mit einer entsprechenden
Menge an PBS-Puffer einschließlich 0,5 % BSA und 0,5 % PFA auf 20000 Thrombozyten/μl
eingestellt. Die Weiterverarbeitung dieser fixierten Stammlösung folgte wiederum
oben beschriebenem Vorgehen für nachträglich fixierte Proben. Die Parallelmessungen zur
Untersuchung des Einflusses der Probenaufbereitung auf das Messergebnis wurden nur
während des Laufband-Stufentestes durchgeführt.
Thrombozytenreaktivität (unfixiert): Das Vorgehen erfolgte identisch zu den Stimulationsversuche
mit nachträglicher Fixierung. Als einziger Unterschied wurde die Immunfärbung mit 4
°C kaltem PBS-Puffer mit 0,5 % BSA ohne Zugabe von Paraformaldehyd gestoppt.
Wärmebad (10 min): Um Hinweise auf den Einfluss der Lagerung im Wärmebad während der
Stimulation bzw. Inkubation auf die Thrombozytenaktivität zu erhalten, wurden 20 μl der
unfixierten Ausgangslösung für 10 Minuten bei 37 °C gelagert und anschließend nach dem
beschriebenen Vorgehen für nachträglich fixierte Proben aufbereitet. Aus Kapazitätsgründen
wurden die beiden letztgenannten Ansätze nur während der Radergometrie durchgeführt.
Probenstabilität: Zur Untersuchung der Proben auf ihre zeitliche Stabilität wurden jeweils für
5 Probanden die Proben nach der eigentlichen Messung im Durchflusszytometer weiterhin bei
4° C und Dunkelheit gelagert und nach 15, 30 und 60 Minuten erneut gemessen.
Bis zur durchflusszytometrischen Messung wurden alle Proben nach dem Abstoppen der
Stimulations- und/oder Markierungsreaktion für ca. 10 min dunkel und auf Eis gelagert. Vom
Zeitpunkt der Blutentnahme bis zur abschließenden Messung vergingen für alle Proben
maximal 45 Minuten. Alle Messungen erfolgten an einem EPICS ® XL/MCL TM 4-Color
Durchflusszytometer. Für die Datenaufnahme und Analyse wurde die System II TM Software
(alles Beckman Coulter, Krefeld - Germany) verwendet. Gezählt wurden je 10000 Thrombozyten
bei einer kontrollierten Flussrate von ca. 200 Ereignissen pro Sekunde.
Die Laseranregung erfolgte mit einem regulierten 15mW Argonlaser bei einer Wellenlänge
von 488 nm. Die Messbereiche für die Immunfluoreszenzfarbstoffe lagen bei 525-550 nm für
FITC und bei 575-600 nm für PE. Das Ausmaß der spektralen Überlappung der beiden
Farbstoffe für die gewählten Verstärkereinstellungen war im Rahmen von Vorversuchen
bestimmt worden. Während der Messungen erfolgte dann durch entsprechende Voreinstellung
in der System II TM Software eine direkte Kompensation der spektralen Überlappung.
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