Experimentelle Untersuchungen zur Transgenese bei Nutztieren

Sequenzen wird die normale Expression nicht beeinträchtigt. Durch Linien-Verpaarung
werden beide Modifikationen in einem Genom kombiniert. So zeigen DNA-Polymerase ß-
defiziente Mäuse einen embryonal-lethalen Phenotyp. Durch konditionale Mutagenese war es
möglich, lebensfähige Nachkommen mit loxP-flankiertem DNA-Polymerase ß-Gen zu
erhalten und selektiv einen Knock-out in T-Zellen zu generieren (Gu et al., 1994). Eine
wichtige Voraussetzung, um mögliche embryonal-letalen Phenotypen vorhersagen zu können,
ist die Analyse der Genexpression in frühen Entwicklungsstadien, z.B. über in situ-
Hybridisierungstechniken (Kues und Wunder, 1992; Kues et al., 1995a, b). Der Nachteil des
Cre/loxP-System und anderer Rekombinasen ist, dass die Methodik relativ aufwendig ist, und
in der Regel nur einmal eine Rekombination erfolgt.
2.6.5 Induzierbare Promotoren und konditionale Expressionskontrolle
Eine Möglichkeit für die konditionale Expressionkontrolle sind sogenannte induzierbare
Promotoren, die mittels exogener Substanzen reguliert werden können. Hierzu gehören der
Metallothioneinpromoter (Nottle et al., 1999), sowie Hitzeschock- und Steroid induzierbare
Promotoren. Jedoch hat sich gezeigt, dass diese induzierbaren Promotoren in der Transgenese
nur beschränkt nutzbar sind, da sie teilweise eine geringe Induktion zeigten, bzw. die
Induktoren unspezifische physiologische Effekte zeigten (Yarranton, 1992). Ein wesentlicher
Fortschritt wurde mit dem Tetracyclin-regulierten System erzielt (Gossen und Bujard, 1992).
Hierbei werden wiederum zwei Transgene in das Genom eingeführt (Abb.5). Ein Konstrukt
wird dabei von einem tetracycylin-sensitiven Promoter (ptTA) kontrolliert. Sobald der
rekombinante Transaktivator (tTA) an den ptTA bindet, wird das Transgen exprimiert. Der tTA
wird von einer zweiten Kassette kodiert; er ist aus zwei Domänen zusammengesetzt: einem
Virusprotein 22 (VP22)-Anteil, mit transaktivierender Funktion und einem Protein-Anteil, der
Tetracyclin binden kann (Gossen et al., 1995). Durch die Bindung von Tetracyclin kommt es
zu einer Konformationsänderung des Gesamtproteins und die DNA-Bindungsfähigkeit geht
verloren.
In dieser Situation wird der pTA nicht mehr aktiviert und das Zieltransgen abgestellt (tet-off-
System). Durch Mutagenese wurden auch tTA-Varianten entwickelt, die erst durch
Tetracyclin-Bindung aktiv an den Promoter binden (Tet-on-system, Furth et al., 1994). In
beiden Fällen werden zwei unabhängige Transgene benötigt, was für den Nutztierbereich ein
wesentliches Hindernis darstellt. Es gibt aber auch erfolgversprechende Ansätze, beide
Transgen-Kassetten auf einem Konstrukt zu verbinden (Schultze et al., 1996) und damit eine
vereinfachte konditionale Expression zu erzielen.
18