Experimentelle Untersuchungen zur Transgenese bei Nutztieren

Konstrukten und die Zellzyklussynchronisierung untersucht (Kues et al., 2002; Anger et al.,
2003; Kues et al., 2005a).
Es wurden Methoden für die Isolation primärer Fibroblasten aus fetalen und adulten Gewebe
von Nutztieren entwickelt und die etablierten Zellkulturen hinsichtlich der
Proliferationsfähigkeit in Kultur und der Zellzyklussynchronisierung detailliert untersucht.
Die primären Zellen konnten genetisch verändert werden (Dieckhoff et al., 2007) und wurden
erfolgreich für Klonversuche verwendet (Schaetzlein et al., 2004; Hornen et al., 2007;
Dieckhoff et al., 2008). Es konnte gezeigt werden, dass porcine fetale Fibroblasten
grundsätzlich Zellzyklus synchronisierbar sind. Maximal wurden Anreicherungen in der
G0/G1-Phase des Zellzyklus von 80-90 % der Zellen erreicht, dabei wurden sowohl
Serumreduktion als auch chemische Inhibitoren des Zellzyklus (Pedrail et al., 1980; Kitagawa
et al., 1994), wie Aphidicolin und Butyrolactone eingesetzt (Kues et al., 2000). Die optimale
Zellzyklussynchronisierung wurde nach 48 Stunden Kultur in serumreduzierten
Zellkulturmedien erreicht; damit sind wesentlich kürzere Synchronisationszeiten möglich, als
zunächst beschrieben (Wilmut et al., 1997; Wells et al., 1999). Bei längeren
Serumentzugszeiten (als 48 Stunden) kam es zunehmend zum apoptotischen Zelltod, wobei
eine direkte Korrelation mit der Serumreduktion und der Zeitdauer der Behandlung
festgestellt werden konnte. In den primären Fibroblasten wurde dabei eine unkonventionelle
Form der Apoptose beobachtet (Kues et al., 2002). Die Messung der Zellzyklusphasen durch
Fluorescence activated cell sorting (FACS) wurde durch Reverse transcriptase-polymerase
chain reaction (RT-PCR)-Bestimmungen der Transkripte des zellzyklus-spezifisch regulierten
Gens Polo-ähnlicher Kinase (Polo-like kinase) auf molekularer Ebene untermauert (Kues et
al., 2000; Kues et al., 2002).
In den Primärkulturen porciner Fibroblasten wurde ein neuer Stammzelltyp gefunden, der mit
Hilfe der Explantatmethode und der Kultur unter hohen Zelldichten angereichert werden
konnte (Abb. 8). Diese fetalen somatischen Stammzellen (FSSCs) konnten aus fetalem
Bindegewebe von Schwein, Maus, Rind und Schaf isoliert werden (Kues et al., 2005a), in
adultem Gewebe kommen sie offenbar in wesentlich geringerer Frequenz vor.
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