Experimentelle Untersuchungen zur Transgenese bei Nutztieren

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A Wt chimeric fetus day 15.5 p.c. B Chimeric fetuses control OG2/Rosa26 Abb.9. Zellchimärismus in Mausfeten nach Injektion von Rosa26/OG2-transgenen FSSCs in Blastozysten. A) Durch histologischen Nachweis der LacZ-Expression (Pfeile) kann die Beteiligung der injizierten Zellen an den Fetalorganen gezeigt werden (rechter Embryo). Links ein Kontrollembryo. B) Nachweis von GFP-positiven Zellen (OG2) in chimärer Keimleiste. Rechts als Positivkontrolle die Keimleiste eines OG2 transgenen Fetuses (aus Kues et al., 2005a). 28
4.2 Gene knock-down Versuche in transgenen Embryonen Das Transkriptom in frühen Säugerembryonen wird zunächst durch maternale mRNAs geprägt, die in der Oozyte angereichert vorliegen (Schultz, 2002). Im Zygotenstadium erfolgt keine Transkription des embryonalen Genoms, die Proteinsynthese ist in diese Phase von den maternalen Transkripten abhängig. Die Aktivierung des embryonalen Genoms (embryonic genome activation) erfolgt spezies-spezifisch bei murinen Embryonen am Ende des Zygotenstadiums, bei humanen und porcinen Embryonen im 4-Zellstadium und bei bovinen Embryonen im 8-Zellstadium (Telford et al., 1990). In der Literatur war gezeigt worden, dass der RNAi-Mechanismus in Säugerembryonen funktionell ist, dabei wurden überwiegend lange doppelsträngige RNA (500-1000 bp) injiziert, und verschiedene Gentranskripte, wie E-Cadherin, Mos, Plat, Oct4, Coxa, Cox5b und Cox6b selektiv degradiert (Svoboda et al., 2000; Wianny et al., 2000; Plusa et al., 2004; Paradis et al., 2005; Nganvongpanit et al., 2007; Cui et al., 2006). Die doppelsträngigen RNAs werden durch das zelleigene Enzym Dicer in siRNAs prozessiert, die dann in dem eigentlichen RNAi-Mechanismus den Abbau von komplementären Transkripten verursachen (Svoboda et al., 2000). Bei diesem Verfahren ist also eine relativ hohe Beladung der Embryonen mit siRNAs notwendig, von denen nur ein Teil funktionell ist, zusätzlich kann es zu unspezifischen Effekten kommen. Zudem kann bei Genen, die ein biphasisches Expressionsmuster zeigen, d.h. die sowohl im maternalen Transkriptom vorliegen, als auch im embryonalen Genom transkribiert werden, nicht ausgeschlossen werden, dass maternale und embryonale Transkripte unterschiedlich sensitiv für den RNAi-Mechanismus sind. So ist bekannt, dass maternale Transkripte eine Halbwertzeit im Bereich von Tagen, embryonale Transkripte dagegem im Bereich von Minuten besitzen (Karlson et al., 2005). In transgenen Mäusen wurde getestet, ob im RNAi-Mechanismus eine differentielle Degradierung von maternalen und embryonalen Transkripten auftritt. Dazu wurde eine funktionelle synthetische siRNA (22 bp) gegen GFP in transgene Mausembryonen injiziert. (Iqbal et al., 2007). Um die Degradation von maternalen und embryonalen Transkripten verfolgen zu können, wurden transgene Mäuse (OG2), die das Green Fluorescent Protein (GFP) unter Kontrolle des keimbahnspezifischen Promoters Oct4 exprimieren (Szabo et al., 2002), verwendet. In transgen-homozygoten Embryonen wird GFP in allen Blastomeren exprimiert, also sowohl maternal als auch embryonal. Bei Verpaarungen mit Wildtypmäusen entstehen hemizygot-transgene Embryonen, bei denen die GFP-Expression davon abhängt, ob sie das Transgen-Allel von der mütterlichen (OG2 mat/- ) oder der väterlichen (OG2 pat/- ) Seite 29
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