Experimentelle Untersuchungen zur Transgenese bei Nutztieren

Konstrukt, die in zwei Mauslinien etabliert und dann durch Verpaarung in einem Genom
kombiniert werden (Lewandowski, 2001). Da der Zeitaufwand für die Verkreuzung von zwei
Nutztierenlinen wesentlich höher ist als bei der Maus, wurde hier ein Ansatz gewählt, der
beide funktionellen Elemente auf einem Konstrukt vereinigt und somit nur die Erstellung
einer transgene Linie erfordert (Kues et al., 2006a). Dazu wurde ein bicistronisches Konstrukt
entworfen (Abb. 14), bei dem eine mRNA gebildet wird, die einen Komplementregulator
(hCD59 oder hDAF) und den Tet-Transaktivator (NTA-RCA) kodiert. Durch die basale
Expression des Konstruktes kommt es dann zu einer autoregulativen Hochregulation der
Expression; die Transgenexpression ist durch Zugabe von Tetracyclin oder Doxycyclin
abstellbar, bzw. regulierbar (Abb. 14). Als eigentliche Transgene wurden die humanen
Komplentregulatoren CD59, bzw. DAF jeweils in das erste Cistron kloniert. Es wurden also
zwei NTA-Konstrukte mit den Kombinationen CD59-tTA und DAF-tTA verwendet. Der
Vorteil dieser Konstrukte gegenüber den Orginalsystem (Gossen und Bujahr, 1992) besteht
darin, dass nur ein Transgenkonstrukt in das Genom eingebracht wird und die Verpaarung
von zwei Linien entfällt.
+
Tet-O
p tTA
TATA box
RCA Transactivator
RCA IRES tTA pA
34
-
Dox
Inactivated
exogenous Dox
Abb. 14. Autoregulative bicistronische Expressionskassette (NTA).
Der tetracyclin-regulierte Promoter besteht aus sieben Tet-Operator-Sequenzen und einem minimalen Promoter
mit einer TATA-Box. Die bicistronische Kassette wird durch eine IRES-Sequenz getrennt, das erste Cistron
kodiert einen RCA (entweder CD59 oder DAF) und das zweite Cistron den Transaktivator. Nach Transkription
führt der tTA durch Bindung an den eigenen Promoter zu einer autoregulativen Hochregulation, durch Zugabe
von Doxycyclin wird der tTA inaktiviert (verändert aus Kues et al., 2006a).
Die Funktionalität der NTA-Kassette wurde durch Transfektion in murine NIH-3T3 Zellen
und in porcine Swine testis epithelium (STE)-Zellen getestet Dabei konnte sowohl in
(AAA) n