Experimentelle Untersuchungen zur Transgenese bei Nutztieren

geerbt haben. OG mat/- Embryonen zeigen eine kontinuierliche GFP-Expression von der Oocyte
bis zur Blastozyste, während OG pat/- -Embryonen erst ab dem 4-8-Zellstadium GFP-positiv
werden (Abb.10). Die RNAi der GFP-Expression kann somit an lebenden Embryonen
selektiv für maternale und embryonale Transkripte evaluiert werden.
Abb. 10. Vererbungsabhängige Expression von Oct4-GFP in hemizygoten Mausembryonen.
A) Embryonen mit paternal vererbten Transgen (OG2 pat/- ) zeigen GFP-Expression ab dem 8-Zellstadium,
Embryonen mit maternal vererbten Transgen (OG2 mat/- ) zeigen in allen Stadium von Zygote bis Blastocyste
GFP-Fluoreszenz. B) Schematischer Aufbau der siRNA, die verwendete siRNA ist mit dem Fluorochrom
Rhodamine konjugiert. C) Injektion der siRNA in OG2 mat/- -Zygote unter Hellfeldbedingungen (oben),
Fluoreszenzanregung für GFP (mitte) und Fluoreszenzanregung für Rhodamin (unten) (aus Iqbal et al., 2007).
Durch Mikroinjektion einer short interfering RNA (siRNA), die gegen die GFP mRNA
gerichtet ist, wurden die unterschiedlichen RNAi-Kinetiken bei Embryonen mit maternaler,
bzw. embryonaler GFP-Expression ermittelt.
Dabei zeigte sich, dass die Expression vom paternalen Allel nahezu komplett inhibiert werden
kann; es war keine GFP-Fluoreszenz nachweisbar. In den OG mat/- Embryonen konnte eine
Reduktion der GFP-mRNA um ca. 95% nachgewiesen werden, aufgrund der hohen
Proteinstabilität von GFP war aber erst in Blastozysten eine relative Verringerung der GFP-
Fluoreszenz feststellbar (Abb.11). Diese Untersuchung zeigt, dass eine einmalige Injektion
von siRNA im Zygotenstadium ausreichend ist, um bis zum Blastozystenstadium eine RNA-
Interferenz zu erreichen. Durch die Verwendung einer synthetischen siRNA, können
unspezifische Effekte, die bei langen doppelsträngigen RNAs beobachtet werden, weitgehend
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