Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodos3. MATERIALES Y MÉTODOS.3.1 Cultivo in vitro de Trichomonas vaginalis. Preparación de antígenos.3.1.1 Mantenimiento de los parásitos.El cultivo axénico de T. vaginalis (C173) se obtuvo a partir del exudado vaginal de unaadolescente sintomática, atendida en el hospital ginecobstétrico “Eusebio Hernández” deCiudad de La Habana (Rojas et al, 2004 b). Los parásitos se mantuvieron a 37 o C en medioTYI-S-33 al 10 % de suero bovino (Sigma, EE UU) inactivado suplementado conestreptomicina-penicilina a 50 g/mL, siguiendo la metodología descrita por Diamond ycolaboradores (Diamond et al, 1978).3.1.2 Preparación de antígenos de secreción de T. vaginalis.Los parásitos mantenidos en cultivo se colectaron y lavaron tres veces con TFS (TampónFosfato Salina, compuesto por NaCl a 136 mmol/L, Na 2 PO 4 a 8,1 mmol/L, K 2 PO 4 a 1,46mmol/L y KCl a 3,48 mmol/L), pH 7,2 por centrifugación a 650 g durante 10 minutos. Elsedimento se resuspendió en medio TYI-S-33 libre de suero a una concentración finalaproximada 1x10 6 parásitos/mL en frascos de cultivo de 75 cm 2 . Posteriormente, losparásitos se incubaron a 37 o C durante 21 horas. Transcurrido este tiempo, el medio secolectó por centrifugación a 1000 g durante 30 minutos (Garber et al, 1987). A 100 mL desobrenadante, se le adicionó 1 mL de una mezcla de inhibidores de proteinasas (Sigma,EEUU) compuesta por fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 10 mmol/L, leupeptin a1000 mol/L, pestatin a 100 mol/L y ácido etilendiaminotetracético (EDTA) a 100mmol/L, se filtró por membrana de 0,2 m y fue congelado a - 20 o C hasta su utilización.3.1.3 Cuantificación de proteínas totales.41