Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodossecar al aire en cámara oscura y se le aplicó glicerina fosfatada. La lectura fue realizada enun microscopio de fluorescencia Leitz modelo Dialux con un ocular de 20 X. Se contaron30 parásitos por área de reacción y se consideró fluorescencia alta (+++) cuando más de 70% de los parásitos estaban marcados, fluorescencia media (++) cuando entre 40 y 70 % delos parásitos fluorescían, baja cuando entre 10 y 40 % (+) mostraban reacción y noreconocimiento cuando menos de 10 % fluorescían.3.5.2 Reconocimiento molecular por inmunotransferencia.La electroforesis (SDS-PAGE) fue realizada según el procedimiento de Laemmli(Laemmli, 1970) descrito en el acápite 3.3.2. Las proteinasas de 60 (donada por el DrGarber, Hospital de Ottawa, Canadá), 62 kDa (purificada en nuestro laboratorio), cada unaa la comcentraciòn de 1 mg/mL, y la mezcla de proteínas patrones, en un rango de pesomolecular entre 53 y 212 kDa (Pharmacia LKB Biotecnology, Suecia), fueron mezcladoscon el tampón muestra y aplicados sobre dos geles de poliacrilamida. Una vez finalizada lacorrida, uno de los geles fue teñido con azul de Coomassie 0,25 % disuelto en una mezclade metanol-ácido acético- agua (5:1:5), durante 30 minutos y decolorado posteriormente enesta mezcla. El otro gel fue lavado durante 15 minutos a temperatura ambiente y enagitación constante con una solución compuesta por Tris 0,025 mol/L-glicina 0,1 mol/Lmetanol20 % pH 8,3. Posteriormente, este último, fue colocado en un equipo deinmunotransferencia (LKB 2117- 250 Novablot electroforetic transfer kit, Suecia) y elpatrón electroforético fue transferido a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 m según elprocedimiento descrito por Tsang y colaboradores (Tsang et al, 1986).Una vez concluida la transferencia, la membrana de nitrocelulosa fue lavada con TFSdurante 10 minutos y luego sumergida durante una hora a temperatura ambiente en unasolución al 5 % de leche descremada disuelta en TFS. Posteriormente, la nitrocelulosa fuecortada en tiras las cuales se sumergieron en una solución de 500 g/mL de cada AcM antiproteinasade 62 kDa y se incubaron toda la noche a 4 º C con agitación constante. Luego detres lavados de 10 minutos cada uno con TFS-T, las tiras se incubaron durante 2 horas a50