Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodosLas células se cosecharon de los frascos de 25 cm 2 bajo condiciones de esterilidad. Lasuspensión celular se centrifugó a 350 g durante 10 minutos a 4 o C. El sobrenadante secolectó para ensayos posteriores y el precipitado fue resuspendido en medio de congelación(40 % de medio RPMI-1640, 50 % de suero fetal bovino, 10% de dimetilsulfóxido). Lascélulas se almacenaron en viales de congelación de 2 mL y se guardaron a -70 o C.Transcurrida una semana los viales se conservaron en nitrógeno líquido.3.4.1.5 Producción de líquido ascítico.Los hibridomas productores de AcMs contra la proteinasa de 62 kDa de T. vaginalis, semantuvieron en cultivo antes de ser inoculados. Las células se cosecharon y lavaron porcentrifugación a 350 g durante 10 minutos a 4 o C en medio de lavado. Se preparó unasuspensión celular a una concentración de 1 x 10 6 células/mL. Se utilizaron ratonesBALB/c, machos, de 6-8 semanas, cuyo peritoneo se estimuló previamente con 0,3 mL dePristane (2, 6, 10, 14-tetrametilpentadecano) (Sigma, EE UU). Se inoculó 1 mL desuspensión celular / ratón. El líquido ascítico producido por cada uno de los ratones seobtuvo por punción intraperitoneal y se centrifugó a 1000 g durante 30 minutos a 4 o C. Elsobrenadante se conservó a -70 o C.Para la obtención de estos AcMs se emplearon los procedimientos generales de latecnología de obtención de hibridomas (Köhler y Milstein, 1975; Godin, 1996).3.4.2 Determinación de clase y subclase de los anticuerpos monoclonales.La clase y subclase de los anticuerpos obtenidos se determinó mediante un ELISA indirectoempleando un juego comercial de inmunoglobulinas (Ig), (anti-IgG1, anti-IgG2a, anti-IgG2b, anti-IgG3, anti-IgA y anti-IgM) y un conjugado anti-inmunoglobulina de ratónperoxidasasegún las instrucciones del fabricante. (ISO-2, Sigma, EE UU).3.4.3 Purificación de los anticuerpos.48