Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodossolución de BSA en TFS al 2,5 %, por una hora a 37 o C. Luego de eliminada la solución debloqueo, se añadió la proteinasa purificada a una concentración de 5 g/mL la cual seincubó por una hora a 37 o C. Al finalizar la incubación, se realizaron seis lavados con TFS-T y se añadieron los conjugados AcMs anti-proteinasa marcados con peroxidasa a ladilución de 1/1000 preparados en TFS-T. Para el AcM anti P-30 como recubrimiento seutilizó como conjugado una mezcla de los AcMs anti-proteinasa. Después de una hora deincubación a 37 o C y de seis lavados con TFS-T se adicionó el sustrato (ver detalles en elacápite 3.4.1.2) con el cual se incubó por 15 minutos en la oscuridad. La reacción fuedetenida con ácido sulfúrico al 12,5% y la absorbancia obtenida se leyó a 492 nm.3.9.3 Identificación de las moléculas reconocidas por los anticuerpos monoclonales enlos antígenos de secreción de T. vaginalis.Para identificar los componentes polipeptídicos que reconocen los AcMs en los antígenosde secreción de T. vaginalis, se utilizó una combinación de electroforesis en gel depoliacrilamida e inmunotransferencia. El procedimiento seguido fue descrito en el acápite3.3.2 y 3.5.2. Se utilizó una mezcla de proteínas patrones en un rango entre 53 y 212 kDa(Pharmacia LKB Biotecnology, Suecia).3.9.4 Determinación del efecto que producen los tratamientos con calor, químicos yenzimáticos en los antígenos purificados.3.9.4.1 Purificación de los antígenos por cromatografía de afinidad.Se procedió a purificar los antígenos de secreción de T. vaginalis reconocidos por uno delos AcM anti- T. vaginalis empleando para ello la cromatografía de afinidad. Dos gramosde Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno fueron hidratados con HCl 1 mmol/L,según las recomendaciones del fabricante (Amersham-Biosciences, EE UU), antes deproceder al acoplamiento covalente del AcM a la matriz, en una proporción de 3-4 mg delanticuerpo por mililitro de gel. Luego del acoplamiento y de bloquearse los sitios libres, seprocedió a eliminar el anticuerpo que no quedó acoplado a la matriz y a equilibrar la58