Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodos3.3 Purificación de la proteinasa de 62 kDa a partir de antígenos desecreción de Trichomonas vaginalis.3.3.1 Purificación de la proteinasa.Al filtrado libre de parásitos se le adicionaron dos volúmenes de etanol a -20 o C, seprocedió a mezclar inmediatamente, a continuación, la mezcla se mantuvo en hielo durante2 horas. El precipitado resultante se centrifugó a 6500 g por 30 minutos y se disolvió entampón HEPES (ácido 1- etanosulfónico 4-(2- hidroximetil piperazina) 10 mmol/L, pH 5,0conteniendo NaCl a 10 mmol/L. A esta solución se le adicionó sulfato de amonio reactivo a176 g/L y se agitó por una hora a 4 ºC. La solución se centrifugó a las mismas condicionesdescritas y al sobrenadante obtenido se le adicionó, nuevamente, sulfato de amonio reactivoa 235 g/L. Se repitió la centrifugación y el sobrenadante fue dializado contra tampónHEPES a 4 o C, con tres cambios del tampón y posteriormente se concentró porultrafiltración, a un volumen final aproximado de 20 mL (Garber y Lemchuk-Favel, 1989).El sobrenadante concentrado se purificó por cromatografía de intercambio iónico ycromatografía de filtración en gel, mediante la tecnología FPLC (Cromatografía líquida dealta resolución para proteínas). La columna K16 x 20 conteniendo dietilaminoetil sefacel(Amersham-Biosciences, EE UU), fue equilibrada con tampón de equilibrio (tampónHEPES, 10 mmol/L, pH 5,0 conteniendo NaCl a 10 mmol/L) y la muestra se aplicó a lacolumna a una velocidad de flujo de 0,7 mL/minutos. La elución se realizó con ungradiente de 10-500 mmol/L de NaCl. Se evaluaron las fracciones por el ensayo enzimáticocon azocaseína como sustrato (ver acápite 3.1.3). Las positivas se mezclaron, según elperfil cromatográfico, se dializaron contra tampón HEPES y se concentraron porultrafiltración con membrana YM-10 (AMICON). Posteriormente, se aplicaron a unacolumna de filtración en gel (Superosa 6) (Amersham-Biosciences, EE UU) previamenteequilibrada con tampón HEPES a un flujo lineal de 0,5 mL/minutos. Las fracciones seevaluaron por el ensayo enzimático (acápite 3.1.4). El peso molecular (PM) de las43