Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodosfracciones con actividad enzimática se determinó por interpolación lineal a partir de lasproteínas patrones (340, 118, 67, 43, 25 kDa).3.3.2 Evaluación del grado de pureza.El grado de pureza de la fracción purificada de antígenos de secreción de T. vaginalis severificó por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % en presencia de duodecil sulfatode sodio (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Las muestras y el patrón, en un rango de PM entre14 y 94 kDa (Pharmacia - LKB Biotecnology, Suecia), fueron mezclados 1:1 con lasiguiente solución: Tris-HCl a 0,5 mol/L, pH 6,8; bromofenol azul y SDS al 0,1 %; glicerolal 1,5 %, e incubados a 100 o C durante 3 minutos. Posteriormente, se aplicaron 20 L delas mezclas al sistema de geles. La corrida se efectuó bajo condiciones desnaturalizantes enmini-cámaras (BioRAD, EE UU) a razón de 15 mA/gel con tampón Tris (0,5 mol/L),glicina (0,192 mol/L), SDS (0,1 %), pH 8,3. Al finalizar la corrida electroforética, serealizó la tinción del gel separador con solución de nitrato de plata (AgNO 3 ) para lo cual seempleó el juego de reactivos de tinción con AgNO 3 (Silver Stain Plus, BioRad, EE UU). ElPM de la proteinasa purificada, se estimó mediante el uso de una curva de calibraciónpreviamente confeccionada a partir de las movilidades relativas de cada proteína patrón conrespecto al logaritmo de su peso molecular.3.4 Obtención y selección de hibridomas productores de anticuerpos antiproteinasade 62 kDa de Trichomonas vaginalis.3.4.1 Obtención de los anticuerpos monoclonales.3.4.1.1 Inmunización de ratones.Se utilizaron 5 ratones BALB/c hembras. Se realizaron 4 inmunizaciones porvía intraperitoneal con intervalos de 15 días entre una y otra. La primera se realizó con laproteinasa (50 μg), previamente purificada, disuelta en TFS, pH 7,2 y emulsificada conAdyuvante Completo de Freund (ACF) (Sigma, EE UU), 0.3 mL proporción 1:1 (v/v); lasegunda con 50 μg de la proteinasa en TFS mezclado con Adyuvante Incompleto de Freund44