Evaluación de la inmunogenicidad y la capacidad protectora de la ...

Materiales y métodos3.8.3 Determinación de óxido nítrico en cultivo de macrófagos tratados con losanticuerpos anti-proteinasa en presencia del parásito.Se realizó la obtención de macrófagos de la cavidad peritoneal de ratones no estimuladospor lavados de esta zona con TFS pH 7,2. El número de células fue determinado por conteoen cámara de Neubauer y fue ajustado a 3x10 5 células/mL de medio RPMI-1640suplementado con 10 % de suero fetal bovino. La suspensión fue depositada en placas de24 pozos (Nunc, Dinamarca) a razón de un mililitro por pozo. Dos horas más tarde seeliminó el medio y se adicionó 1 mL de medio RPMI-1640TYI-S-33 (1:1 v/v)conteniendo 6x10 4 parásitos y 1 mg de los AcMs. Se incluyeron en el estudio un controlcon el AcM anti p-30 y otro en presencia de un AcM anti-proteinasa más N-monometilarginina (L-NMMA) (10 mol/L), utilizado, éste ultimo, como inhibidor de la producciónde óxido nítrico. Dos horas más tarde, se estimularon los macrófagos con lipolisacarido(LPS) serotipo 055, B 5 de Escherichia coli (Sigma, EE UU) a 50 unidades/mL e IFN a 10ng/mL. El cultivo fue incubado a 37 o C por 18 horas en atmósfera de CO 2 . El experimentose repitió dos veces y cada determinación se realizó 5 veces. El óxido nítrico es oxidadorápidamente a nitrito en medio de cultivo y la concentración de nitrito es un indicador de laproducción de óxido nítrico.El sobrenadante de cultivo libre de células fue mezclado en placas de microtitulación conigual cantidad de reactivo Griess (sulfanilamida al 1 %, naftiletilendiamida al 0,1 % en 2,5% de ácido fosfórico). Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente por 10minutos. La absorbancia fue medida a 550 nm en un lector de microplacas (DYNEX-Technologies, EE UU). Por último, la concentración de nitrito fue calculada con el empleode una curva estándar de nitrito de sodio (3-500 mol/L) (Rockett et al, 1992).55