Capítulo 2Para compor o grupo externo mais próximo foram selecionados os psitacídeos australianosMelopsittacus undulatus (tribo Platycercini) e Cacatua goffini (família Cacatui<strong>da</strong>e) e o psitacídeo <strong>da</strong>Nova Zelândia Strigos habroptilus (tribo Strigopini, família Psittaci<strong>da</strong>e, NC_005931; Harrison e col.,2004). Falco peregrinus (NC_000878; Mindell e col., 1998; AY461399, Griffiths e col., 2004), Aburriaaburri (AF165466, AY143680, AY140740, AY140768, AY165454, AF165442; Pereira e col., 2002) eGallus gallus (X52392, Desjardins e Morais, 1990; AF143730, Groth e Barrowclough, 1999) foramselecionados como grupos externos mais distantes para enraizar a topologia. A classificação dospsitacídeos adota<strong>da</strong> nesse trabalho segue Collar (1997), exceto por Propyrrhura, para o qual adotamosPrimolius de acordo com Penhallurick (2001).2.2.2. Extração de DNA e sequenciamentoO DNA foi extraído a partir de tecido sangüíneo em solução contendo 0,1% de SDS, Tris-HCl100mM (pH 8.0), EDTA 10 mM e 10 mg/mL de proteinase K mantido a 55 o C por aproxima<strong>da</strong>mente 4horas. O DNA foi purificado por procedimento padrão com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (Bruforde col., 1992). A amplificação dos segmentos de DNA foi realiza<strong>da</strong> por “Polymerase Chain Reaction”(PCR) em 25 µL de reação com solução tampão 1x (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 22,5mM, gelatina a 0,01%, 160 µg/ mL de BSA), 2 µM de ca<strong>da</strong> dNTP, 1µM de ca<strong>da</strong> “primer”, 1 U de Taqpolimerase (Pharmacia) e 25-50 ng de DNA. As condições <strong>da</strong> reação de PCR foram: desnaturaçãoinicial a 95ºC por 5 minutos (min.), seguido de 30 ciclos de 95 o C por 60 segundos (seg.), 50 o C por 25seg., 72 o C por 80 seg., e uma extensão final de 72 o C por 7 min. Os segmentos amplificados forampurificados por corte de ban<strong>da</strong> do gel de agarose e centrifugação através de uma ponteira com filtro.As seqüências foram obti<strong>da</strong>s nos seqüenciadores automáticos Li-Cor 4200 bi-direcional e ABI3100 deacordo com protocolo sugerido pelos fabricantes. Foram obti<strong>da</strong>s as seqüências de DNA do genenuclear RAG-1, e dos genes mitocondriais citocromo b, NADH2, ATPase 6, ATPase 8, COIII, DNAr12S e DNAr 16S. Os “primers” usados foram R1 (5’- GACAAACATCATCTCAGGAAGAAGAT -3’), R11(5’- GGACCAGTAGATGATGAAACTCCT -3’), R13 (5’- TCTGAATGGAAATTCAAGATGTT -3’), R14(5’- TTCCTGTGGATACTCCAGCA -3’), R17 (5’- CCCTCCTGCTGGTATCCTTGCTT -3’), R18 (5’-GATGCTGCCTCGGTCGGCCACCTTT -3’), R19 (5’- GTCACTGGGAGGCAGATCTTCCA -3’), R21 (5’-GGATCTTTGAGGAAGTAAAGCCCAA -3’), R20 (5’- CCATCTATAATTCCCACTTCTGT -3’), R22 (5’-GAATGTTCTCAGGATGCCTCCCAT -3’), R24 (5’- GCCTCTACTGTCTCTTTGGACAT -3’) e R2B (5’-GAGGTATATAGCCAGTGATGCTT -3’) para o RAG-1 (Groth e Barrowclough, 1999); b1 (5’- CCATCCACCATCTCAGGATGATGAAA - 3’), b52 (5’- GNAAATCYCACCCNCTWCTHAAAAT -3’) e b6 (5’- GTC32
Capítulo 2TTCAGTTTTGGTTTACAAGAC -3’) para o citocromo b (Kocher e col., 1989); MetL (5’- AAGCTATCGGGCCCATACCCG –3’), ND2H (5’- CCTTGAAGCACTTCTGGGAATCAGA -3’), ND2-54H (5’- GGGGTGGTGAGATTTTGCGA- 3’) e ASNH (5’- GATCRAGGCCCATCTGTCTAG -3’) para o NADH2; LysL(5’- CAGCACTAGCCTTTTAAGCT -3’), COIIIRH (5’- ATTATTCCGTATCGNAGNCCYTTTTG -3’), A5(5’- TAGGAGTGTGCTTGGTGTGCCATT- 3’) e ATP6L (5’- AAAYATYTAATGGCACACCAAGC- 3’)para os genes ATPase 6, ATPase 8 e COIII; L1537 (5’- AATCTTGTGCCAGCCACCGCGG -3’) e12Send (5’- GTGCACCTTCCGGTACACTTACC -3’) para o DNAr 12S; 16Sa (5’- AAGCCWANCGAGCYGGGTGATAGCTGG -3’), 16Sb (5’- CATAGATAGAAACCGACCTGG -3’), 16Sc (5’- TTCTTCAAGGTCGCCCCAACC -3’) e 16Se (5’- GCACGGTTAGGATACCGCGGCCG -3’) para o RNAr 16S (OliverHaddrath, comunicação pessoal). As seqüências de DNA foram deposita<strong>da</strong>s no GenBank com osnúmeros de acesso: DQ143281-DQ143297 para citocromo b; DQ143298-DQ143324 para NADH2;DQ143250-DQ143280 para os genes ATPase 6, ATPase 8 e COIII; DQ143208-DQ143228 para 12SrDNA; e DQ143229-DQ143249 para o 16S rDNA. Foram obti<strong>da</strong>s do GenBank as seqüências decitocromo b para Diopsittaca nobilis (AF370769, Tavares e col., 2004), Pionopsitta barrabandi,Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (AY669424, AY669437 e AY669439; Ribas e col., 2005) ede NADH2 para Amazona farinosa (AY194461; Eberhard e Bermingham, 2004), Pionopsittabarrabandi, Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (AY669468, AY669481 e AY669486; Ribas ecol., 2005).2.2.3. Análise <strong>da</strong>s seqüências de DNAAs ambigüi<strong>da</strong>des nas fitas complementares de DNA foram verifica<strong>da</strong>s com o Sequencher 4.1.2(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan). O alinhamento dos genes foi verificado visualmente noMacClade 4.0 (Maddison e Maddison, 2000). As lacunas de alinhamento, as regiões com alinhamentoambíguo e as regiões de sobreposição entre as ATPases 8 e 6, e a ATPase 6 e o COIII foramexcluí<strong>da</strong>s <strong>da</strong> matriz de <strong>da</strong>dos. A composição de bases, as taxas de transição e transversão e adistância genética entre seqüências de nucleotídeos foram calcula<strong>da</strong>s no PAUP* 4.0b10 (Swofford,2002). O grau de saturação <strong>da</strong>s seqüências foi avaliado para ca<strong>da</strong> gene pela relação entre o númerode transições e o número de transversões pelas distâncias par a par corrigi<strong>da</strong>s entre os táxons.Diferenças de composição de base entre táxons não são corrigidos pela maior parte dosmétodos de reconstrução filogenética e topologias inadequa<strong>da</strong>s podem ser escolhi<strong>da</strong>s quando asdiferenças de composição são expressivas (Penny e col., 1990; Lockhart e col., 1994; Foster e Hickey,1999; Chang e Champbell, 2000; Haddrath e Baker, 2001; Paton e col., 2002). Por isso, os sítios33
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