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28 Labor aktuell Warum auf respiratorische Viren testen? Virusinfektionen der Atemwege stellen weltweit ein erhebliches medizinisches Problem dar. Die klinische Diagnose erweist sich als schwierig, da verschiedene respiratorische Viren ähnliche klinische Symptome hervorrufen können. Auch die Entdeckung neuer bedeutender respiratorischer Viren in den letzten Jahren ist klinisch eine Herausforderung. Außerdem können die häufig auftretenden Mischinfektionen oder Koinfektionen einen wesentlichen Einfluss auf die Behandlung und Genesung haben. Luminex hat genau dafür einen innovativen molekulardiagnostischen Multiplex-Assay, den xTAG RVP FAST, entwickelt, der von <strong>Abbott</strong> Molecular angeboten wird. Richtige Diagnose – gezielte Therapie Bei der Untersuchung eines Patienten kann man auf zahlreiche respiratorische Krankheitserreger (viral und bakteriell) stoßen. Ein Arzt muss wissen, welcher Erreger der Infektion zugrunde liegt, um eine wirksame Behandlung zu verordnen (Virostatikum oder Antibiotikum) und die Verbreitung der Infektion einzuschränken. Leider lässt sich die Ursache einer Atemwegsinfektion mit herkömmlichen Methoden nur schwer bestimmen. Viele Ärzte schicken Patienten mit grippeähnlichen Symptomen ohne Behandlung nach Hause. Oder sie behandeln mit ungeeigneten Medikamenten, statt einen diagnostischen Test anzuwenden. Es überrascht nicht weiter, dass eine Studie des New England Journal of Medicine mit an Grippe erkrankten Kindern gezeigt hat, dass bei lediglich 28 % der stationär behandelten und 17 % der ambulant behandelten Kinder die richtige Diagnose gestellt wurde (Poehling et al. 2006 N. Engl. J. Med. 355 (1): 31–40). Wirtschaftliche Bedeutung der Atemwegsinfektionen Influenza breitet sich weltweit rasch in saisonalen Epidemien aus und stellt eine erhebliche wirtschaftliche Belastung in Form von Krankenhauskosten oder Produktivitätseinbußen dar. In den USA wurde z. B. kürzlich geschätzt, dass Grippeepidemien die Wirtschaft jährlich 71–167 Mrd. Dollar kosten (http://www.who.int/csr/disease/influenza/ en/). Für sehr junge und ältere Menschen sowie für Menschen, die an Lungenerkrankungen, Diabetes, Krebs, Nierenoder Herzerkrankungen leiden, stellen Atemwegsinfektionen ein großes Risiko dar. Bei diesen Menschen kann eine Infektion zu schweren Komplikationen bei bestehenden Grunderkrankungen oder sogar zu Pneumonie und zum Tod führen. Im Rahmen jährlicher Grippeepidemien sind 5–15 % der Bevölkerung von Infektionen der oberen Atemwege betroffen. Es wird davon ausgegangen, dass diese Epidemien jährlich weltweit in drei bis fünf Millionen Fällen zu schweren Erkrankungen und zu 250.000 bis 500.000 Todesfällen führen. In den Industrieländern treten die meisten derzeit mit Grippe assoziierten Todesfälle bei älteren Menschen über 65 Jahren auf (http://www.who. int/csr/disease/influenza/en/). Viruserkrankungen der oberen Atemwege kommen häufig vor, rund sechs bis neun Infektionen treten pro Jahr bei Kindern und zwei bis vier Infektionen bei Jugendlichen und Erwachsenen auf. Infektionen der unteren Atemwege sind zwar seltener, jedoch mit höheren Kosten verbunden. Die wirtschaftliche Tab. 1: Sensitivität und Spezifität von xTAG RVP FAST (n = 1518) Virus (Analyt) Sensitivität Spezifität Menschliche Influenza A 93,24 % 95,62 % H1-Subtyp von Influenza A 100 % 96,95 % H3-Subtyp von Influenza A 95,83 % 96,69 % Menschliche Influenza B 93,10 % 98,22 % RSV 91,20 % 98,06 % Parainfluenza 1 80 % 99,26 % Parainfluenza 2 76 % 99,33 % Parainfluenza 3 76,29 % 98,87 % Entero-Rhinovirus* 100 % 89,20 % Adenovirus 97,10 % 98,90 % Metapneumovirus 97,22 % 98,87 % * Klinische Proben konnten nicht durch bidirektionale Ablaufplanung nach Enterovirus bewertet werden.
Labor aktuell 29 respiratorischen Viren innerhalb von vier Stunden einschließlich Nukleinsäureextraktion. Diese Multiplex-PCR zeichnet sich durch hohe Sensitivitäten und Spezifitäten für den Nachweis der verschiedenen Viren bzw. Subtypen aus (Tab. 1 und Tab. 2). Der xTAG RVP FAST erfolgt in 3 Schritten: Luminex 200 System Bedeutung dieser Atemwegsinfektionen lässt sich nur schwer einschätzen. Klar ist jedoch, dass das unnötige Verschreiben von Antibiotika und die damit verbundene steigende Resistenz der Bakterien große finanzielle Auswirkungen haben. Eine rasche Diagnose der respiratorischen Viren bei Krankenhauspatienten kann dagegen in verschiedenen Bereichen von großem Vorteil sein: Krankenhausaufenthalte werden um 50 %, die Einnahme von Antibiotika um 30 % und die Anwendung unnötiger diagnostischer Verfahren um 20 % reduziert. Aus Sicht des öffentlichen Gesundheitswesens können molekulardiagnostische Tests eine verbesserte Überwachung von Krankheiten in der Bevölkerung gewährleisten, da sich diese Methoden durch hohe Sensitivität und Spezifität auszeichnen (Henrickson. 2005 Pediatr. Ann. 34 (1): 24–31). Diagnose von Atemwegsinfektionen Die derzeitigen diagnostischen Möglichkeiten sind entweder schnell und unzuverlässig oder langsam, dafür aber sensitiv. Mit den Standardtestmethoden (EIA, DFA und Kultur) werden nicht alle relevanten Erreger erfasst, so dass manche Infektionen oder Mischinfektionen übersehen werden können. Aus diesem Grund werden oft verschiedene Methoden zeitaufwändig und teuer kombiniert oder hauseigene RealTime-PCR-Methoden eingesetzt. Letztere sind nicht standardisiert und zeigen große Unterschiede im Spektrum der detektierten Erreger. Mit dem CE-zertifizierten Multiplex-Nukleinsäuretest xTAG RVP FAST von Luminex wird diese Lücke geschlossen. Der von <strong>Abbott</strong> Molecular angebotene Test ermöglicht effizient und zuverlässig den Nachweis der 18 häufigsten Tab. 2: Sensitivität und Spezifität von xTAG RVP FAST im Vergleich zur RealTime-RT-PCR (n = 285) Virus (Analyt) Sensitivität Spezifität Parainfluenza 4 100 % 99,65 % Entero-Rhinovirus* 96,49 % 89,47 % Coronavirus OC43 100 % 98,57 % Coronavirus NL63 100 % 100 % Coronavirus HKU1 100 % 100 % Coronavirus 229E Nicht geprüft 100 % Menschlicher Bocavirus 100 % 98,19 % * Von 57 positiven klinischen Echtzeit-RT-PCR-Proben waren 49 Rhinoviren und 8 Enteroviren. 1. Multiplex-Tag-RT-PCR Nach der Nukleinsäurenextraktion wird der Virusextrakt amplifiziert. Für jeden Virus-/ Subtyp entstehen spezifische Tag-markierte und biotinylierte PCR-Amplicons. 2. Hybridisierung/Detektion Das PCR-Amplicon wird zum xMAP Bead-Mix und zur Reporter-Substanz gegeben. Der xMAP Bead-Mix besteht aus verschiedenen farbmarkierten Kügelchen (Beads), die jeweils für eine bestimmte Virus-Zielsequenz spezifische Anti-Tag-Markierungen tragen. Bindet das zu analysierende PCR-Produkt über eine Tag/Anti-Tag- Hybridisierung an das entsprechende Bead, wird durch den gebildeten Komplex mithilfe der Reporter-Substanz nach Anregung durch Laserlicht Fluoreszenz emittiert. 10 Unique Infrared Dye Concentrations 3. Analyse In einer Doppelmessung identifiziert das Luminex-Gerät die Farbcodierung der jeweiligen Bead-Sorte (roter Strahl) und misst parallel die im Falle einer spezifischen Hybridisierung am selben Bead entstehende Fluoreszenz (grüner Strahl). Das Ergebnis gibt Auskunft über die An- bzw. Abwesenheit der viralen Zielregion in der Probe. Der xTAG RVP FAST ermöglicht auf einfache Weise eine schnelle und zuverlässige Differentialdiagnose einer viralen Atemwegsinfektion, welche die komplexen Testalgorithmen mit kombinierten Methoden ablöst. Er ermöglicht somit eine verbesserte Patientenversorgung und Infektionskontrolle, trägt zur Vermeidung unnötiger Kosten bei, vermindert Antibiotika- Resistenzen und stellt ein hocheffektives neues Hilfsmittel zur Überwachung dar. n 10 Unique Red Dye Concentrations
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