Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 21 -
- Photographieren von Bakterien
Zur photographischen Darstellung sollten die Bakterienkulturen eine hohe Zelldichte aufweisen;
ist diese zu gering, wird die Zellsuspension durch Zentrifugation konzentriert. Drei Tropfen von
20, 22 und 25 µl werden mit einer 0.1 ml- oder 0.2 ml-Pipette auf den Agar-beschichteten Objektträger
pipettiert. Jeder Tropfen wird sofort mit einem Deckglas (18x18 mm) abgedeckt. Um
ein Verdunsten der Flüssigkeit zu verhindern, werden alle vier Seiten des Deckglases mit Paraffinlösung
abgedichtet. Dazu wird ein Metallspatel erhitzt, mit der flachen Seite in das Paraffin
eingetaucht und anschließend am Deckglasrand vorsichtig angesetzt.
Bestimmung des Gram-Typs
a) Färbung nach GRAM (Modifiziert nach Bartholomew)
1) Ausstrich der Bakterien aus frischer Kultur (schnellwüchsige Bakterien maximal 24 h alt) auf
sauberem Objektträger (oder Deckglas) herstellen und an der Luft trocknen lassen. Ausstrich fixieren
durch dreimaliges Ziehen durch die Flamme (nicht Pyrolysieren!). Auf demselben Objektträger
Vergleichsausstriche mit Referenzbakterien herstellen (mit einem Gram-negativen und einem
Gram-positiven Stamm).
2) Fixierte Bakterien 1 min mit Huckers Ammoniumoxalat-Kristallvioett-Lösung färben.
3) Farblösung ablaufen lassen, Ausstrich 5 sec mit fließendem Wasser waschen.
4) Kaliumjodid-Jodlösung 1 min einwirken lassen.
5) 5 sec mit fließendem Wasser abwaschen.
6) Differenzieren: 3 x je 1/2 min in 3 Töpfen n-Propanol entfärben.
7) 5 sec waschen
8) Ausstrich eventuell mit Wasser und Deckglas mikroskopieren, um Qualität zu prüfen
9) Eventuell Gegenfärbung 1 min mit Safranin. Farblösung ablaufen lassen und Ausstrich kurz
mit fließendem Wasser abwaschen.
10) Ausstrich trocknen, angefärbte Bakterien mit 10- oder 40- facher Vergrößerung suchen
und dann direkt mit Immersionsöl ohne Deckglas
im Hellfeld im Objektiv Ölimmersion, 100fache Vergr., bei offener Blende mikroskopieren.
11) Resultat mit Gram-negativen und Gram-positiven Referenzbakterien vergleichen.
b) Kalilauge-Test (nach Gregersen)
1 Tropfen einer 3%igen KOH-Lsg. wird auf einen Objektträger gebracht. Mit einer Impföse wird
Zellmaterial (Kolonie oder abzentrifugierte Zellen) in diesen Tropfen etwa 5 - 10 sec eingerührt.
Zieht man bei vorichtigem Anheben der Platinöse einen schleimigen Faden nach, handelt es sich
um Gram-negative Zellen. Beim Einrühren Gram-positiver Zellen in die KOH wird kein schleimiges
Material gebildet.