Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 49 -
ne an beiden Seiten des Kamms auf Höhe der vorderen Glasplatte befinden (die Spitzen der anderen
Zähne berühren dann gerade die obere Seite des Gels). Vor dem Auftragen werden schließlich
alle Proben im Thermocycler denaturiert (70°C, 3-5 min), sofort auf Eis gestellt und erst dann mit
einer speziellen Spritze (8-channel-Hamilton syringe) aufgetragen (nicht mehr als 0,8 µl Probe
pro Tasche). Nun den Deckel des Puffertanks wieder aufsetzen und die Elektrophorese fortsetzen.
Der Lauf erfolgt über Nacht und dauert je nach Länge der zu sequenzierenden Fragmente etwa 5 -
10 Stunden. Die erzeugte Datei wird automatisch gespeichert. Das Programm Data Collection
kann somit einfach beendet werden.
Auswertung des Gels:
Die Auswertung der Proben erfolgt am selben Computer (Software LI-COR 4200), nach den
Vorgaben des DNA Analysis Systems Training Manual über das Programm: Image Analysis. Falls
die Sequenzier-Elektrophorese noch läuft, kann man per Alt und Tab-Taste zum Ausgangsmenü
wechseln, ohne die Sequnezierung abzubrechen und dort das Program Image Analysis anklicken.
Über File und Open Image kann die entsprechende Datei ausgewählt werden. Danach Image Notepad
(eigenes Icon) anklicken, um am Ende des Notpads die Auflistung der Probennummern und
ihre zugehörigen Geltaschen zu ermitteln. Unbedingt notieren: Gegenüberstellung file-name zu
Primer-Probencodierung. Jedes Gelspurquartett erhält einen eigenen Filenamen durch Vergabe
von Buchstaben. Buchstabe m für Spur 1-4, auf der eine bestimmte DNA mit einem bestimmten
Primer läuft; Buchstabe n für Spur 5-8, auf der eine andere DNA mit einem anderen Primer läuft
etc. (Buchstabe j auslassen wegen Verwechselungsgefahr!). Unter Enhancement können Kontrast
(s.u.) und Helligkeit verändert werden. Unter Sequence über Lane Definition werden jeder Gelspur
die aufgetragene Base so zugeordnet, wie sie aufgetragen wurden, also ACGT. Die Zuordnung
erfolgt wie im folgenden Beispiel:
Doppelklick z. B. auf A mit der linken Maustaste; halten und die entstehende Linie an den linken
Rand der A-Spur schieben und loslassen (Definition des linken Randes). Dann links dieser
Linie wieder linke Maustaste betätigen, halten, verschieben bis zum rechten Rand der A-Spur,
loslassen. (Definition des rechen Randes). Damit ist Spur A fertig definiert und kann per OK bestätigt
werden. Achtung: Bei reverse Primern ist die A-Probe mit T zu benennen usw.! Weiter ist
noch folgendes zu beachten:
Unter Sequence über Band Spacing kontrollieren, ob die vorgegebenen Linienmitten durch die
einzelnen Banden gehen; ansonsten entsprechend verändern. Unter Enhancement über Background
Substraction oder Bands Kontrast optimieren.
Unter Sequence kann nun semi-automatisches Sequenzieren gewählt werden. Die Bestätigung
der vom Rechner vorgeschlagenen Banden erfolgt per Doppelklick mit der linken Maustaste. Falls
zweifelhaft mit rechter Taste klicken, eine Korrektur erfolgt mit Backspace. Für Basen die der
Computer nicht eindeutig identifizieren kann, werden bestimmte Platzhalter gesetzt, die für bestimmte
Kombinationen von Basen (sog. Ambiguities, Mehrdeutigkeiten) stehen. Die Nomenklatur
nach IUPAC ist in der unteren Tabelle angegeben. Die Speicherung der Sequencen erfolgt
unter File mit Save as...Path ist z.B. DNA4000/DATA/FPRAKT. Der File lautet z.B. FP02i. Filenamen
eingeben! Er wird dann auf der Festplatte als smp-file (sample-file) gespeichert. Um den
file auf Diskette zu speichern, unter Report File New anklicken, dann den File als rpt- file (reportfile)
unter a: abspeichern. Wenn die alte Sequenz wieder aufgerufen werden soll: Im Programm
Image Analysis, in dem wir uns befinden, über File und Open Sample die gewünschte Datei öffnen.
Dabei auf Dateinnamen der Sample-files achten, da nur ein Dateiname für das Bild/Gel existiert
(z.B. FP02), aber mehrere Dateinamen für mehrere Sequencen auf dem Bild/Gel exisitieren
(z.B. FP02A, FP02B etc.). Soll eine neue Sequenz auf selbem Gel erstellt werden: File und New
Sample anwählen, soll eine neue Sequenz auf anderem Gel erstellt werden: File und Open Image
anwählen. Insbesondere die äußeren Sequenzen zeigen oft keine gradlinige Bandenspur. Per Smile-Correction
unter Enhancement kann per Anklicken von Define und dem manuellen Verschieben