Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 29 -
Materialien
- Filtrieraufsatz (Millipore 20 mm Glasfilterhalter)
- 0.2 µm Anodisc-Filter (Whatman)
Chemikalien
- 0.5% TWEEN 80 (sterilfiltriert)
- 0.22 µm sterilfiltriertes ddH 2 O
- 0.22 µm sterilfiltrierter PBS-Puffer (130 mM NaCl, 5 mM NaH 2 PO 4 ; pH 7.2)
- Fixativ (4% Paraformaldehyd + 0.1% Triton X100in 1 x PBS; pH 7.25)
- DAPI-Lösung (10 µg/ml; sterilfiltriert)
- Einbettungsmittel DABCO (25 mg Diazabicyclo-octan + 1 ml PBS + 9 ml Glycerin)
- Färbelösung:
1ml Fixativ
+ 930 µl ddH 2 O (sterilfiltriert)
+ 70 µl DAPI-Lösung
Methode
Zu den mit Glutardialdehyd (6 ml, 3%) fixierten Sedimentproben 100 µl TWEEN 80 zugeben und
die Proben mit Ultraschall behandeln (5x5 sec). In ausgeglühten Reagenzgläsern 10 ml PBS-
Puffer vorlegen. Vorbehandelte Proben nochmals vortexen und 10 µl davon in den PBS-Puffer
überführen. Proben erneut vortexen und über mit Glasfaser-Filter (GF) unterlegte Anodisc-
Membranfilter filtrieren. Reagenzglas und Filtrieraufsatz mit sterilfiltriertem Wasser nachspülen.
Membran trockenfiltrieren und während des Vakuums abnehmen. Filtrieraufsatz vor jedem neuen
Filtrationsvorgang mit Spülmittel, ddH 2 O und steril filtriertem ddH 2 O säubern.
In einem kleinen Wägeschälchen DAPI-Lösung ansetzen. Filter mit der Probenseite nach oben
vorsichtig auf die Färbelösung auflegen und 5 min im Dunkeln färben. Filter(rückseite) auf Küchenpapier
im Dunkeln trocknen und danach auf einem Objektträger in DABCO einbetten, Deckglas
auflegen. Filter unterm Epifluoreszenzmikroskop auszählen.
Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe (nach Hobbie et al.)
2-5 ml einer Wasserprobe mit Bakterien werden in einem Reagenzglas mit ca. 200 µl einer partikelfreien
0.1% Acridin-Orange Lösung 2 min lang gefärbt und dann durch einen mit Irgalanschwarzlösung
(0.1%) vorgefärbten 0.2 µm Nucleporefilter abfiltriert. Als Unterlage kommt auf
den Filteruntersatz ein Cellulosemembranfilter. Der Nucleporefilter wird dann auf einem Objektträger
getrocknet, mit einem fluoreszenzfreien Immersionsöl (z.B. Siliconöl) versehen und mit
einem Deckglas bedeckt. Die Probe wird bei fluoreszenzfreier Ölimmersion unter dem Epifluoreszenzmikroskop
bei Blaulichtanregung betrachtet. Es werden pro Filter 10 Zählquadrate ausgezählt.
Die Probenmenge sollte so gewählt sein, dass pro Zählquadrat ca. 30-50 Bakterien sichtbar
sind Berechnung der Bakterienzahl/ml:
Zahl/ml = (y • A)/(a • V)
y: mittlere Zellzahl pro Zählquadrat
A: effektive Filtrationsfläche (µm 2 )
a: Zählquadratfläche (µm 2 )
V: Filtrationsvolumen (ml)