Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 31 -
ATP-Standard (0.5 µM):
30.26 mg ATP (ATP Na 2 H 2 * 3 H 2 O, Boehringer, Mannheim) werden ad 100 ml in Tris-Puffer
(siehe oben) gelöst und zu je 1 ml in Cryo-Tubes portioniert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
An jedem Versuchstag wird diese ATP-Stammlösung aufgetaut und in 3 Schritten insgesamt
1:1000 in Tris-Puffer verdünnt. Diese ATP-Standard-Lösung hat eine Konzentration von
0.5 µM i.e. 0.5 pmol/µl.
Durchführung der Messung:
160 µl Tris-puffer werden mit 40 µl Test-Reagenz in einer Polystyren Küvette durch langsames
Drehen gemischt und der Leerwert der Strahlung im Luminometer gemessen. Die Küvette wird
nun wieder herausgenommen, 10 µl Zellextrakt werden zugesetzt (resultierendes Volumen 210
µl), gemischt und wieder die Lichtemission ermittelt. Darauf wird die Messung zweimal durch
Zugabe von je 5 µl ATP-Standard (2.5 pmol) in dieselbe Küvette geeicht (resultierende Volumina:
215 µl und 220 µl). Durch diese interne Standardisierung werden Fehler, die durch die unterschiedlichen
Komponenten der einzelnen Proben verursacht werden können, ausgeschlossen.