Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 43 -
elektrischen Feld isoliert wird. Um das Gel gießen zu können, müssen diese Seiten daher zunächst
mit einem Klebestreifen zugeklebt werden.
Es werden 1,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer 1 facher Stärke gegeben (1 x TAE-Puffer: 40 mM
Tris(hydroxymethyl)aminomethan; 1 mM EDTA, pH 7,4 eingestellt mit Acetat). Für ein
Standard-Gel benötigt man 0,6 g Agarose in 40 ml Puffer. Die Agarose wird in einer Mikrowelle
so lange erhitzt, bis eine klare, schlierenfreie Lösung entstanden ist. Diese wird anschließend heiß
in die vorbereitete Wanne gegossen. Anschließend wird über ein Ende und in der Mitte der Wanne
ein Kunststoffkamm gehängt, und zwar so, daß dessen Zähne einen Abstand von ca. 1 mm
(Schichtdicke eines Objekträgers) zum Wannenboden haben. Auf diese Weise bekommt das
fertige Gel an einem Ende und in der Mitte kleine Taschen die der Aufnahme der PCR-
Amplifikate dienen. Nach etwa 20 min ist das Gel erstarrt und die Kämme können vorsichtig (!)
herausgezogen werden. Zum Schluß werden die Klebebandstreifen entfernt. Wird das Gel nicht
sofort benutzt, so muß es in einem mit 1 x TAE-Puffer gefüllten, geschlossenem Behälter vor dem
Austrocknen geschützt werden.
2.) Elektrophorese
Die Wanne mit dem Gel wird in eine Elektrophorese-Kammer gestellt (die offenen Enden in
Feldrichtung). Anschließend wird die Elektrophorese-Kammer so hoch mit 1 x TAE-Puffer
gefüllt, daß das Gel vollständig eintaucht.
Für PCR-Produkte die nicht mit der RedTaq erstellt wurden wird auf einem Stück Parafilm
1 µl-Tropfen Loading-Puffer 6 facher Stärke vorgelegt (6 x Loading-Puffer: 0,25% (w/v)
Bromphenolblau; 40 % (v/v) Glyzerin in 1 x TAE). Je 5 µl DNA-Probe werden mit je einem
Tropfen Loading-Puffer gemischt, indem mit einer Pipette mehrfach hoch und runter gesogen
wird. Anschließend wird jede Probe vorsichtig, präzise und luftblasenfrei in eine leere Tasche des
Gels pipettiert. Von PCR-Produkten die mittels der RedTaq amplifiziert wurden, werden 5 µl
ohne weitere Zugabe eines Loading-Puffers in die Kammern des Gels pipettiert. Die RedTaq
enthält einen Loading-Puffer der das sofortige Auftragen aufs Gel ermöglicht. Als Standard wird
eine 100 bp Ladder verwendet (Konz. 125 ng/µl), die schon mit einem Loading-Puffer versehen
ist. Vom Standard werden jeweils 5 µl auf das Gel aufgetragen.