Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 37 -
DNA abbauen könnte, gut geschützt. Für eine erneute Verwendung der DNA siehe das Protokoll
der Ethanol-Fällung.
Die restlichen 20 µl DNA dienen als Template in der PCR oder können für weitere molekularbiologische
Untersuchungen verwendet werden.
Protokoll zur DNA-Extraktion aus Wasserproben und Flüssigkulturen
Die Wasserproben wurden über einem 0,2 µm-Polycarbonat-Filter abfiltriert. Im Eppendorfgefäß
wurden dem Filter 0,5 g Zirkonium Perlen, 20 µl SDS 25%, 600 µl Phosphatpuffer und 600 µl
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zugesetzt. Um die Zellen aufzuschließen, und um Fremdstoffe
wie Verunreinigungen durch das Probenwasser, sowie Zellbestandteile von der vorhandenen
Bakterien-DNA zu entfernen wurde das Eppendorfgefäß drei Minuten gevortext, danach 10 min
bei 60°C in einem Wasserbad inkubiert und wieder drei Minuten lang gevortext. Die organische
Phenolphase der Probe wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei Raumtemperartur und
10.000 rpm von der wässrigen Phasen getrennt. Die DNA befand sich nun in der oberen, wässrigen
Phase, die in ein neues Eppendorfgefäß überführt wurde. Zur ursprünglichen Probe wurden
weitere 300 µl Phosphatpuffer zugegeben, erneut eine Minute gevortext und wie vorher 10 min
zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde zum ersten dazugegeben. Den Überständen wurde
nun wieder 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zugesetzt, um die restlichen Verunreinigungen
von der DNA zu entfernen. Nach wiederholtem Vortexen und Zentrifugation konnte wieder
der Überstand abgenommen und in ein neues Gefäß überführt werden. Sofern noch ein durch
Proteine verursachtes, weißes Präzipitat an der Interphase zu sehen war, wurde der Vorgang mit
erneuter Zugabe von 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol wiederholt.
Anschließend wurde die wässrige Lösung, in der sich die DNA befand, nach Hinzufügen von
30 µl Natriumacetat und 2,25 ml Isopropanol über Nacht gefällt. Am nächsten Tag konnte die
DNA der Lösung durch Zentrifugation bei 4°C und 13000 rpm für 30 min pelletiert werden. Der
Überstand wurde abpipettiert und das Pellet wurde mit 1,5 ml Ethanol (70%) gewaschen. Die
Lösung wurde wiederum unter gleichen Bedingungen 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen
und das DNA-Pellet für drei Minuten in der Speed Vac getrocknet. Die präzipitierte und
getrocknete DNA wurde in 50 µl PCR-Wasser aufgenommen und stand für weitere molekularbiologische
Untersuchungen zur Verfügung.
Quantifizierung von DNA mit Pico Green
Je 1 µl Probe werden in 899 µl TE-Puffer aufgenommen. Zur Quantifizierung werden zu jeder
Probe 100 µl Pico Green Reagenz (Pico Green 1:40 in TE-Puffer angesetzt) hinzupipettiert. Mittels
eines Blindwertes und eines Standards (Blindwert: 900 µl TE-Puffer + 100 µl Pico-Green
Reagenz; Standard: 899 µl TE-Puffer + 1 µl Heringssperma (100 ng/µl) + 100 µl Pico Green
Reagenz) kann der DNA Gehalt in der Probe bestimmt werden. Dabei werden die Proben in einem
Spektrofluorophotometer (Shimadzu) bei einer Extinktion von 460 nm und einer Emission
von 540 nm gemessen. Das Gerät liefert dabei Werte in ng/µl. Hierbei ist darauf zu achten, daß
der Standard nicht von 100 ng/µl abweichen sollte (im Ergebnis). Vor der Messung müssen die
einzelnen Proben nach Zugabe des Pico Green Reagenz gevortext und 5 Minuten dunkel inkubiert
werden.
Während der gesamten Messung ist mit Handschuhen und Kittel zu arbeiten. Die Abfälle werden
im Färbeabfall entsorgt.