Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 35 -
achten, damit diese beim nächsten Zentrifugationsschritt ebenfalls in der gleichen Position zentrifugiert
werden. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und 500 µl 70 %iges Ethanol
auf die Proben zum Waschen gegeben. Es folgt eine erneute Zentrifugation (15.000 rpm, 10
min). Der Überstand wird verworfen und die Proben werden für 5 - 10 min in der Speed Vac
(Unterdruck wird durch eine Pumpe erreicht), bei einer mittleren Temperatureinstellung, zentrifugiert.
Hierdurch wird das restliche Ethanol entfernt. Mindestens 10 min vor Inbetriebnahme der
Speed Vac sollte die Kühlfalle angestellt werden, um die Pumpe vor Flüssigkeiten zu schützen.
Die Nukleinsäuren können nach Trocknung in 50 µl TE-Puffer aufgenommen werden. Nach einer
Inkubation von 30 min bei Zimmertemperatur können die Proben dann bei 4 °C für den Gebrauch
gelagert werden. Proben die längere Zeit nicht benötigt werden und dementsprechend gelagert
werden sollen, können wieder im Fällungsmix (2,6 fache Volumen) aufgenommen werden und bei
– 70 °C eingefroren werden.
RNA-Extraktion und DNase-Verdau
Um reine RNA zu erhalten ist es notwendig Kontaminationen durch DNA vorzubeugen und/oder
zu entfernen. Dies ist Notwendig, da in einer PCR zusätzlich vorhandene DNA mitamplifiziert
wird. Bei der Extraktion von RNA wird die Phenol/Chloroform Reinigung bei einem pH-Wert
von 4,0 durchgeführt. Bei diesem pH-Wert fällt ein Teil der DNA in der Interphase aus. Die RNA
löst sich dagegen weiterhin vollständig in der wässrigen Phase. Da nach der Extraktion, Reinigung
und der Fällung immer noch DNA in der Probe vorhanden ist, muss die Probe einem DNase-
Verdau unterzogen werden, um somit die letzten Spuren von DNA zu entfernen.
Dafür werden die RNA Proben nach der Ethanol-Fällung nicht in TE-Puffer aufgenommen, sondern
in 500 µl DNase-Puffer. Weiter werden 5 µl DNase hinzupipettiert und die Proben 60 min
bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Anschließend werden die Schritte ab der Phenol/Chloroform
Reinigung wiederholt (dient der Entfernung der DNase).
Um später nachzuweisen ob sich noch DNA in den RNA Proben befindet, werden die Proben in
einer PCR eingesetzt. Sollte sich in dieser PCR Nukleinsäuren amplifizieren lassen (RNA wird
nicht amplifiziert), ist die Probe noch mit DNA kontaminiert. Sollten keine Produkte zu erkennen
sein, kann man davon ausgehen, daß die Probe DNA frei ist.
Kurzdarstellung der kombinierten DNA/RNA Extraktion
- Aufschluss der Zellen im Sediment mittels Beadbeater
- Aufteilung der Proben in DNA und RNA Proben
- Phenol/Chloroform Reinigung (pH Werte beachten)
- Ethanol-Fällung
- Aufnahme der DNA in TE-Puffer
- DNase-Verdau mit den RNA Proben
- Phenol/Chloroform Reinigung (pH 4,0)
- Ethanol-Fällung
- Aufnahme der RNA in TE-Puffer