Methodenskript

Methodenskript
AG Cypionka/Paläomikrobiologie
Stand 10.11.2003

Methodenskript AG Cypionka - 1 -
I N H A L T S V E R Z E I C H N I S
Herstellung von Wachstumsmedien 3
Mineralisches Grundmedium für Anaerobier 4
Mineralisches Grundmedium für marine Aerobier 5
Spurenelementlösungen 5
Selenit-Wolframat-Lösung 6
Vitaminlösungen 6
Colorimetrische Bestimmung von Ammonium 7
Colorimetrische Bestimmung von Nitrit 7
Colorimetrische von Nitrat 7
Sulfidbestimmung nach Cline 10
Schnellnachweis von Schwefelwasserstoff 10
Turbidometrische Bestimmung von Sulfat 11
Colorimetrische Bestimmung von Thionaten 14
Colorimetrische Bestimmung von Sulfit 13
Colorimetrische Bestimmung von Schwefel 13
Colorimetrische Bestimmung von Orthophosphat 14
Proteinbestimmung nach Lowry 15
Proteinbestimmung nach Schmidt et al. 15
Proteinbestimmung nach Bradford 16
Bestimmung der Trockenmasse von Bakterienkulturen 17
Bestimmung der Carotinoide phototropher Bakterien 17
Bestimmung der Bacteriochlorophylle a, c, d und e 18
Berechnung der Zellzahlen aus MPN-Reihen 19
Berechnung der Zellzahlen aus Verdünnungsreihen 20
Herstellung von Agar-beschichteten Objektträgern 20
Bestimmung des Gram-Typs 21
Isolierung von Reinkulturen anaerober Bakterien 22
Geißelfärbung 23
Katalase-Test 23
Oxidase-Test 23
Substratspektren aerober Bakterienisolate 24
Aufnahme von Wachstumskurven 25
ß-Glucosidase-Aktivität 26
ß-Glucosaminidase-Aktivität 27
Leucin-Aminopeptidase 27
ß-Glucosidase-Aktivität in Mikrotiterplatten 28
Bestimmung der Gesamtzellzahl 28
Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe 29
ATP-Bestimmung 30
Isolierung von DNA 32
DNA/RNA-Extraktion aus Sedimentproben 33
Schnelltest zur Quantifizierung von DNA 36
DNA-Extraktion mittels eines Kit von BioGene 36
Quantifizierung von DNA mit Picogreen 37
DNA-Quantifizierung am Microtiterplattenreader 38
PCR 40
Seite

Methodenskript AG Cypionka - 2 -
Agarose-Gelektrophorese 42
Sequenzieren von DNA 45
Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese 51
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) 53
Quantitative PCR 60
Literatur 66

Methodenskript AG Cypionka - 3 -
Herstellung von Wachstumsmedien
Die Wachstumsmedien werden in speziell dafür angefertigten Glasgefäßen nach WIDDEL (1980,
Abb. 1) zubereitet. Die Chemikalien wurden in angegebener Reihenfolge (siehe Tabellen) eingewogen
und unter Rühren gelöst. Die Abfüllglocke wird in Filztuch und Alufolie eingewickelt, der
Gasansatzstutzen mit dem Wattefilter mit einem Gummistopfen verschlossen. Die seitlichen
Schraubverschlüsse werden ebenfalls verschlossen, allerdings wird während des Autoklavierens
ein seitlicher Schraubverschluß um etwa eine halbe Umdrehung geöffnet, um ein Zerplatzen des
Gefäßes durch Überdruck zu verhindern. Das Medium wird 50 min bei 121°C autoklaviert.
Abb. 1: Glaskolben zur Herstellung Medium für Anaerobier (nach WIDDEL 1980).
Nach dem Autoklavieren werden Supplementlösungen im Gasgegenstrom durch einen seitlichen
Stutzen zugegeben.
Oxische Medien:
Nach dem Autoklavieren werden die seitlichen Schraubverschlüsse dicht verschlossen und der
Gummistopfen aus dem Gasansatzstutzen entfernt. Luft kann jetzt nur durch den Wattefilter in
den Kolben eindringen. Um dem abgekühlten Medium die Supplementlösungen zugeben zu können
wird der Kolben an N 2 angeschlossen 5 kPa. Der Kolben mit dem fertigen Medium bleibt am
Stickstoff angeschlossen, da der Gasüberdruck zum Abfüllen benötigt wird. Das fertige Medium
wird unter der Abfüllglocke in sterile Röhrchen oder Flaschen abgefüllt.
Anoxische Medien:
Nach dem Autoklavieren wird der Gasraum über dem Medium kurz mit N 2 /CO 2 (80/20, v/v) mit
N 2 gespült, die Schraubverschlüsse dicht verschlossen und das Medium unter Rühren bei 5 kPa
unter N 2 /CO 2 (80/20, v/v) abgekühlt. Dem abgekühltem Medium wurden aseptisch im Gasgegenstrom
die Supplementlösungen zugegeben. Der pH-Wert der Medien wurde (falls notwendig) mit
steriler 1 N Na 2 CO 3 oder 1 N HCl auf 7.2 - 7.4 eingestellt. Das fertige Medium wird unter der
Abfüllglocke in sterile Röhrchen oder Flaschen abgefüllt.

Methodenskript AG Cypionka - 4 -
Mineralisches Grundmedium für viele anaerobe Bakterien (nach Cypionka &
Pfennig 1986)
(S => süß, B => Brackwasser, M => marin)
S B M S B M
Substanz MW mM g/l
KH 2 PO4 136.09 1.5 1.5 1.5 0.20 0.20 0.20
NH 4 Cl 53.49 5.0 5.0 5.0 0.25 0.25 0.25
KCl 74.55 4.0 4.0 4.0 0.30 0.30 0.30
CaCl 2 * 2 H 2 O 147.02 1.0 1.0 1.0 0.15 0.15 0.15
MgCl 2 * 6 H 2 O 203.30 2.5 10 15 0.50 2.00 3.00
NaCl 58.44 --- 222 342 --- 13 20
Resazurin (0.5 mg/ml) ml 0.50 0.50 0.50
Autoklavieren und unter N 2 abkühlen lassen danach aus sterilen Stammlösungen zusetzen:
Spurenelementlösung SL10
1.0 ml
Vitaminlösung (7 Vit.)
1.0 ml
Se+W-Lösung 1) (0.1 mM) 2*10-8 M
0.2 ml
2)
NaHCO 3 (1 M => 30 mM) 30 ml
Dithionit (kristallin) wenig, bis zur Entfärbung < 17 mg
pH 3) einstellen mit steriler 1 M HCl oder Na 2 CO 3
1) Nicht für alle Stämme benötigt
2) Vorsicht! Schutzgefäß, keine heißen Fläschchen berühren!
3) 6.8 - 7.0 für Medium S, 7.0 - 7.3 für Medium B und Medium M
Anmerkung: Die Medien B und M unterscheiden sich von S nur durch die Konzentrationen von
NaCl und MgCl 2 . Durch Zugabe eines Salzkonzentrats (NaCl, 5 M, + MgCl 2 , 0.2 M, ≈30 %
Salz) lassen sich die Medien B und M aus weniger salzhaltigem Medium herstellen:
45 ml/l S-Medium für S => B
68 ml/l S-Medium für S => M
23 ml/l B-Medium für B => M
Häufig zu verwendetende Elektronendonatoren und -akzeptoren (mM)
H 2 (80 %) + CO 2 (20 %) + Acetat (2 mM), Lactat (20), Na 2 SO 4 (10)
Na 2 S 2 O 3 (10), Na 2 S 2 O 5 (5), NaNO 3 (10)

Methodenskript AG Cypionka - 5 -
Mineralisches Grundmedium für marine aerobe Bakterien
→ vor dem Autoklavieren
dest. Wasser 1000 ml HEPES 2,38 g
NaCl 24,32 g KBr (0,84 M) 1 ml
MgCl 2 * 6 H 2 O 10 g H 3 BO 3 (0,4 M) 1 ml
CaCl 2 * 2 H 2 O 1,5 g SrCl 2 (0,15 M) 1 ml
KCl 0,66 g NH 4 Cl (0,4 M) 1 ml
Na 2 SO 4 4 g KH 2 PO 4 (0,04 M) 1 ml
Spurenelementlsg. SL 10 1 ml NaF (0,07 M) 1 ml
Selenit-Wolfram-Lsg. 0,2 ml
KBr, H 3 BO 3 , SrCl 2 , NH 4 Cl, KH 2 PO 4 , NaF werden aus sterilen Stammlösungenzugesetzt.
Vor dem Autoklavieren wurde das Medium mit 4 M NaOH auf pH 7,2-7,4 eingestellt.
→ nach dem Autoklavieren dem abgekühlten Medium zusetzen.
NaHCO 3 –Lösung
0,2 g in 10 ml H 2 O
10-Vitaminlösung (5fach konz.)
2 ml
Spurenelementlösungen (nach Tschech und Pfennig 1984)
SL10 1) SL11 SL12
Destilliertes Wasser ad 1000 ml ad 1000 ml 2) ad 1000 ml 2)
Salzsäure, 25 %
10 ml
EDTA-Di-Natriumsalz 5.2 g 3.0 g
FeSO 4 * 7 H 2 O --- 1.1 g
FeCl 2 * 4 H 2 O 1.5 g 1.5 g ---
CoCl 2 * 6 H 2 O 190 mg 190 mg 190 mg
MnCl 2 * 2 H 2 O 100 mg 100 mg 50 mg
ZnCl 2 70 mg 70 mg 42 mg
NiCl 2 * 6 H 2 O 24 mg 24 mg 24 mg
Na 2 MoO 4 * 2 H 2 O 36 mg 36 mg 18 mg
H 3 BO 3 6 mg 6 mg 300 mg
CuCl 2 * 2 H 2 O 2 mg 2 mg 2 mg
1) Zuerst das Eisenchlorid in der Salzsäure lösen
2) Vor dem Auffüllen mit Wasser auf pH 6.0 einstellen
• Anwendung: 1 ml pro Liter Medium.

Methodenskript AG Cypionka - 6 -
SL9
Wie SL11, aber anstelle von EDTA-Di-Na:
Nitrilotriessigsäure (NTA): 12.8 g
Selenit-Wolframat-Lösung
(nach Widdel 1980)
Destilliertes Wasser
NaOH
Na 2 SeO 3 · 5 H 2 O
Na 2 WO 4 · 2 H 2 O
1000 ml
0.4 g
6 mg
8 mg
Vitaminlösungen
7-Vitamine-Lsg. 1) 10-Vitamine-Lsg 2)
Destilliertes Wasser 180 ml 1000 ml
Biotinlösung 3)
20 ml
Biotin
10 mg
Nikotinsäure 20 mg 25 mg
Thiamin-Dichlorid 10 mg 25 mg
p-Aminobenzoesäure 10 mg 25 mg
Ca-D(+)-Pantothenat 5 mg 25 mg
Pyridoxamin-Dihydrochlorid 50 mg 50 mg
Cyanocobalamin (Vit. B 12 ) 10 mg 5 mg
Folsäure
10 mg
Riboflavin
25 mg
Liponsäure (Thioctinsäure)
25 mg
1) nach Pfennig 1978
2) 5fach konzentriert, nach Balch et al. 1979
3) 10 mg Biotin in 100 ml Wasser, in der Wärme lösen
Lösung in sterile Schraubdeckelflaschen sterilfiltrieren.
Kühl und dunkel aufbewahren!
Anwendung: 1 ml pro Liter Medium (7-Vitaminelsg), bzw. 2 ml pro Liter Medium (10-
Vitaminelsg.).

Methodenskript AG Cypionka - 7 -
Bestimmung von Ammonium-Stickstoff (nach Chaney und Marbach)
Lösungen:
A) 3 g Phenol + 3 mg Na-nitroprussid (Na-pentacyanonitrosylferrat (III) in 100 ml H 2 O dest. Gekühlt
ca. 2 Wochen haltbar.
B) 2 g NaOH in 80 ml H 2 O dest., abkühlen lassen, 0.5 ml NaClO-Lösung mit 13% wirksamem
Chlor zusetzen und auf 100 ml auffüllen. (Vorsicht! Stark ätzend!).
Vorgehen:
10 ml Probe werden in ein Reagenzglas pipettiert, 1 ml Lösung A zugesetzt, gemischt, 1 ml Lösung
B zugesetzt und erneut gemischt. Eine Stunde bei Zimmertemperatur abgedunkelt stehen
lassen. Bei zu starker Farbreaktion muß die Bestimmung mit verdünnter Probe durchgeführt werden.
Anschließend Messung der Absorption bei 635 nm Wellenlänge gegen Ammonium-freien
Leerwert. Niederschlag vorher abzentrifugieren! Der Nachweis ist sehr empfindlich. Die Glasgeräte
müssen sauber sein; evtl. vorher nochmals spülen. Eichkurve: mit (NH 4 ) 2 SO 4 im Bereich 0 -
100 µM aufnehmen (Achtung: 2 x Ammonium!).
Prinzip der Reaktion siehe Abb.1
Bestimmung von Nitrit-Stickstoff
(nach Göttinger Kursskript)
Lösungen:
A) 1.65 g Sulfanilsäure wird in 375 ml heißem Wasser gelöst und mit 125 ml Eisessig versetzt.
B) 0.5 g a-Naphthylamin wird in 100 ml Wasser suspendiert, 125 ml Eisessig zugesetzt, bis zur
Lösung gerührt und mit H 2 O ad 500 ml aufgefüllt. Vorsicht, stark carcinogen! Nicht mit den
Händen berühren und nichts verschütten. Pipettierhilfe verwenden und benutzte Pipetten und Gefäße
sogleich gut spülen.
Vorgehen:
0.5 ml Probe in Reagenzglas, 0.5 ml Lsg. A zusetzen, mischen, 2.5 ml Lsg. B zusetzen. Messung
nach 10 min. bei 530 nm.
Eichkurve: 0 - 100 µM mit KNO 2 (Vorsicht, carcinogen!)
Prinzip der Reaktion siehe Abb.2
Bestimmung von Nitrat-Stickstoff (nach Goltermann)
Lösungen:
A) 1 N HCl
B) 1 N NaOH

Methodenskript AG Cypionka - 8 -
C) Reduktionsmischung:
C1) 0.039 g CuSO 4 * 5 H 2 O in 100 ml H 2 O.
C2) 0.12 g Hydrazinsulfat N 2 H 4 * H 2 SO 4 in 25 ml H 2 O.
5 ml C1 werden mit 25 ml C2 gemischt und mit H 2 O ad 50 ml aufgefüllt. Diese Reduktionsmischung
und die Lösung C2 sind nicht haltbar und müssen täglich frisch hergestellt werden.
Vorgehen:
10 ml zentrifugierte, partikel- und sulfidfreie Probe (wenn nötig, Sulfid mit CO 2 austreiben) wird
mit 0.25 ml Lsg. B versetzt, 0.25 ml Lsg. C zugefügt, gemischt und 30 min bei 28-30 °C stehengelassen.
Anschließend wird 0.25 ml Aceton und nach 5 Min. 0.25 ml HCl zugefügt. Das durch
Reduktion gebildete Nitrit wird anschließend nach der obigen Methode bestimmt. Vorsichtsmaßnahmen
wie bei der Nitritbestimmung!
Eichkurve: 0, 5 10, 20, 50, 100 und 200 µM KNO 3 .
Prinzip der Reaktion:
Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Die Reaktion verläuft allerdings nicht ausschließlich bis zum Nitrit.
Daher Nitrit-Eichkurve nicht einfach übernehmen, sondern Eichkurve von Nitrat ausgehend erstellen!

Methodenskript AG Cypionka - 9 -
Abb. 1-3: Reaktionsprinzipien einiger photometrischer Tests

Methodenskript AG Cypionka - 10 -
Colorimetrische Sulfidbestimmung (nach Cline)
Reagenz:
1 g N,N-Dimethyl-p-Phenylendiammonium-Dichlorid (DMPD) und 1.5 g FeCl 3 * 6 H 2 O in
25%iger HCl lösen, mit 25%iger HCl auf 50 ml auffüllen. Vorsicht! Die Lösung ist stark sauer
und carcinogen! Reagenz nicht mit Händen berühren, stets Pipettierhilfe verwenden, auf anhaftende
Reste achten! Benutzte Pipetten und Gefäße nicht stehen lassen, sondern alsbald spülen.
Vorgehen:
In verschraubbaren 15 ml-Reagenzgläsern 0.4 ml Reagenz (mit Eppendorfpipette) vorlegen. Dazu
5 ml Probe pipettieren. Reagenzglas verschließen, sofort mischen und nach frühestens 20 min die
Extinktion bei 670 nm messen. Sollte die Extinktion größer als 1 werden, muß weniger Probe
eingesetzt werden (und dann nach Entwicklung der blauen Farbe das Volumen mit dest. Wasser
auf 5 ml ergänzt werden).
Eichkurve: Als Standard dient eine Na 2 S-Lösung: 500 ml H 2 O wird in einem Meßkolben mit
einem NaOH-Plätzchen versetzt und für mindestens 20 min durch eine lange Kanüle mit N 2
durchspült. Danach wird ein in dest. H 2 O gewaschener und getrockneter, genau gewogener Na 2 S
* 9 H 2 O, von etwa 0.6 g, hinzugegeben und der Kolben (N 2 -begast) mit einem Gummiseptum
verschlossen. Diese Stammlösung enthält etwa 5 mM Sulfid (= 5 nmol/µl bei 0.6 g Na 2 S * 9 H 2 O)
und ist nur unter Stickstoff maximal 1 Tag haltbar. Für die Eichkurve werden in 12 Reagenzröhrchen
5 ml H 2 O vorgelegt, mit einem Gummiseptum verschlossen und 20 Minuten mit Stickstoff
ausgeblasen. Mit einer Hamiltonspritze (Vorsicht beim Durchstechen des Gummiseptums!) werden
0, 2, 5, 10, 20 und 50 µl (0 bis 250 nmol Sulfid) der Sulfidstammlösung zugesetzt, gemischt
und sofort 0.4 ml Reagenz mit einer 1 ml-Spritze hinzugefügt (Doppelansätze). Nach 20 Minuten
wird die Extinktion bei 670 nm gegen einen Ansatz ohne Sulfidlösung gemesssen. Zur Berechnung
der molaren Konzentration der Na2S-Lösung wird das Formel-Gewicht für Na 2 S * 9 H 2 O
angenommen, was sich bisher bewährt hat. Für sehr genaue Messungen müßte ein Aliquot der
Na 2 S-Lösung in eine frische, genau eingestellte saure J-KJ-Lösung gegeben und das überschüssige
Jod mit einer Na 2 S 2 O 3 -Lösung zurücktitriert werden.
Prinzip der Reaktion siehe Abb.3
Schnellnachweis von Schwefelwasserstoff (nach Widdel)
Reagenz:
HCl 50 mM
mit CuSO4 5 mM
für den Leerwert:
HCl 50 mM
Vorgehen:
Mit bis zu 0.5 ml Probe eine 3 ml-Küvette mit Reagenz (unter heftiger Rührung mit einem Mikrorührfisch)
auf 2.0 ml auffüllen. Innerhalb einer Minute Extinktion bei 436 nm gegen Wasser
messen. Als Leerwert wird dieselbe Menge der Probe mit 50 mM HCl ohne CuSO4 versetzt und
photometriert.

Methodenskript AG Cypionka - 11 -
Eichkurve aufnehmen im Bereich bis 2 µmol/Ansatz
Dieser Test kann auch qualitativ zur Überprüfung der Sulfidbildung in Bakterienkulturen verwendet
werden. Auch ohne Rührung und Photometer zeigt das kolloidal ausfallende Kupfersulfid eine
kräftig braune Färbung.
Turbidometrische Bestimmung von anorganischem Sulfat (nach Cypionka und
Pfennig, Tabatabai)
Reagentien:
A) 10 g Citronensäure * H 2 O, H 2 O ad 80 ml, lösen und mit 120 ml Glycerin (99.5%) mischen.
B) 0.5 g BaCl 2 * 2 H 2 O, 5 g Citronensäure * H 2 O, H 2 O ad 50 ml.
Vorgehen:
2 ml Probe (wenn nötig, klarzentrifugiert) mit 2 ml Lösung A schlierenfrei mischen. 0.5 ml Lösung
B zusetzen und sofort schlierenfrei mischen. Nach 30 - 45 Minuten erneut mischen und die
Trübung bei 436 nm gegen sulfatfreie Kontrolle messen. Immer Doppelbestimmungen mit verschieden
verdünnten Proben durchführen! Stets Eichstandards über den erwarteten Konzentrationsbereich
der Proben mitmessen!
Eichkurve im Bereich von 0.1 - 5.0 µmol Sulfat pro Testansatz anlegen. Für die Erstellung der
Tiefenprofile werden die von Sulfid und Partikeln befreiten Wasserproben (1 l) verwendet.
Prinzip der Reaktion: Ba 2+ + SO 4 2- → BaSO 4 (unlöslich)
Citronensäure säuert den Ansatz an und komplexiert die Ba 2+ -Ionen. Aus den Komplexen entstehen
bei der Reaktion mit Sulfat sehr kleine Kristalle mit hoher optischer Dichte. Glycerin verlangsamt
die Sedimentation der Kristalle.
Sulfat-Schnelltest mit 0.2 M HCl und 0.2 M BaCl 2
1 ml Kultur mit 2 Tropfen HCl ansäuern, umschütteln, 2 Tropfen BaCl 2 zusetzen. Sofortige
Trübung zeigt Sulfat, langsam auftretende evtl. Thiosulfat (=> Schwefel) an.
Photometrische Analyse von Thionaten (nach Kelly et al. 1969; Fitz und Cypionka 1990)
Der photometrische Nachweis von Thiosulfat, Trithionat und Tetrathionat beruht auf der alkalischen
Cyanolyse der Thionate, die zu Thiocyanatäquivalenten umgesetzt werden. Zur Unterscheidung
der Thionate wird die Cyanolyse-Reaktion bei verschiedenen Temperaturen und zum Teil
mit CuSO 4 als Katalysator durchgeführt. Die dabei entstehenden Thiocyanate können dann als rotbrauner
Komplex mit Eisen (III) photometrisch quantifiziert werden.

Methodenskript AG Cypionka - 12 -
(0°C)
I S 4 O 6 2- + 3 CN - + H 2 O → S 2 O 3 2- + SO 4 2- + 2 HCN + SCN -
(0°C, CuSO4)
II S 2 O 3 2- + CN - → SO 3 2- + SCN -
(100°C, CuSO4)
III S 3 O 6 2- + 3 CN - + H 2 O → SO 3 2- + SO 4 2- + 2 HCN + SCN -
Daraus folgt, daß bei der Messung von Ansatz I lediglich die Konzentration von Tetrathionat ermittelt
wird. Bei der Messung des Ansatzes II werden die Konzentrationen von Tetrathionat, des
bei der Cyanolyse entstehenden Thiosulfates und des bereits im Ansatz befindlichen Thiosulfates
erfaßt. Bei der Messung des Ansatzes III wird die Gesamtkonzentration aller im Ansatz vorhandenen
Thionate (Thiosulfat, Tri- und Tetrathionat) ermittelt.
Lösungen:
1.) NaH 2 PO 4 - NaOH - Puffer 1 M, pH 7.4
2.) KCN 1.25 M
3.) CuSO 4 * 5 H 2 O 0.375 M
4.) Fe(NO 3 ) 3 * H 2 O 1.5 M
gelöst in 4 M HClO 4 , Volumenzunahme beim Lösen!
=> 100 ml HClO 4 + 92 g Fe(NO 3 ) 3 => 150 ml Gesamtvol.
Als Standards werden 1 mM Lösungen von Thiosulfat, Tetrathionat und Trithionat täglich frisch
angesetzt.
Ansätze:
In jedes Reagenzglas werden 0.06 ml der Lösung 1.) vorgelegt. Dann wird die Probe hinzupipettiert
(max. 2.25 ml) und mit Aqua bidest. auf 2.31 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Der Standard
wird als Mix mit allen drei Thionaten eingesetzt. Es wird für jeden Ansatz eine Nullprobe gemacht,
mit welcher der Nullabgleich bei der photometrischen Messung durchgeführt wird. 3 verschiedene
Ansätze (I,II u. III)
Ansatz I zur Bestimmung von Tetrathionat:
Ansatz I wird 10 min auf 0°C abgekühlt, bevor 0.06 ml der Lösung 2.) und 0.06 ml Aqua bidest.
hinzugefügt werden (Mischen!). Der Ansatz bleibt dann ca. 20 min im Eisbad.
Ansatz II zur Bestimmung von Thiosulfat:
Ansatz II wird 10 min auf 0°C abgekühlt. Dann wird 0.06 ml der Lösung 2.) hinzupipettiert (Mischen!).
Nach einer 10-minütigen Inkubationszeit werden 0.06 ml der Lösung 3.) hinzupipettiert
(Mischen!), bevor der Ansatz weitere 10 min im Eisbad verbleibt.

Methodenskript AG Cypionka - 13 -
Ansatz III zur Bestimmung von Trithionat:
Nachdem dem Ansatz III 0.06 ml der Lösung 2.) hinzugefügt werden, wird er 45 min im Wasserbad
gekocht. Die Reagenzgläser sind dabei durch Glasmurmeln verschlossen. Danach wird der
Ansatz auf 0°C abgekühlt (ca. 10 min) bevor 0.06 ml der Lösung 3.) hinzupipettiert werden (Mischen!).
Danach bleibt der Ansatz weitere 10 - 15 min im Eisbad.
Abschließend werden zu allen Ansätzen 1 ml der Lösung 4.) hinzugefügt (Mischen!). Wenn die
Ansätze dann auf Raumtemperatur wieder erwärmt sind, kann die Extinktion 460 nm gemessen
werden. Entsprechend den oben angegebenen Reaktionsgleichungen sind die Konzentrationen der
Thionate wie folgt zu ermitteln:
Konzentration von Tetrathionat: Ansatz I
Konzentration von Thiosulfat: Ansatz II - 2 x Ansatz I
Konzentration von Trithionat: Ansatz III - Ansatz II
Colorimetrischer Sulfitnachweis (nach Pachmayr)
Reagenz A: Säureentfärbte Fuchsinlösung
400 mg Fuchsin werden mit Aqua bidest. und 125 ml Schwefelsäure (konz.) versetzt und mit
Aqua bidest. auf einen Liter aufgefüllt.
Reagenz B: Formaldehyd 32 %ige Lösung
Ansatz:
Die Probe wird mit Aqua bidest. auf 8.9 ml aufgefüllt. Dann erfolgt die Zugabe von 1 ml Reagenz
A und 0.1 ml Reagenz B (mischen!).
10 min nach der letzten Zugabe erfolgt die photometrische Messung bei 570 nm gegen einen Ansatz
ohne Sulfit.
Colorimetrischer Schwefel-Nachweis (nach Chan und Suzuki, 1993)
Lösungen:
(1) 10 ml A. dest + 190 ml Aceton
(2) 0.2 g NaCN + 125 ml Lösung (1)
(3) 0.4 g FeCl 3 * 6 H 2 O + 5 ml A. dest
(4) Aceton
(5) Petrolether
(6) 6.4 mg S° in 10 ml DMSO (Endkonzentration 20 mM)
(7) 3.2 mg S° in 10 ml Petrolether

Methodenskript AG Cypionka - 14 -
Vorgehen:
- Herstellen einer S°-Eichreihe mit Lösung (6) (weißer Niederschlag) und Puffer von 5-1000 µM
0 µM = Leerwert
- Extraktion: 0.5 ml Bakteriensuspension (oder Eichlösung) + 1.0 ml Lösung (5) in Eppendorf-
Caps
- mischen (30 sec)
- Zentrifugation: 14 000 Upm, 10 min in der Eppendorfzentrifuge der Überstand wird klar
- Ansatz: 0.5 ml Überstand + 1.0 ml Lösung (2) in E.-Caps
- mischen u. 2 min reagieren lassen
- Meßansatz: 0.95 ml Lösung (4)
+ 0.05 ml Lösung (3)
+ 0.50 ml "Ansatz" in E.-Caps
- mischen, es bildet sich ein bräunlicher Niederschlag
- Zentrifugation: 14 000 Upm, 1 min in der Eppendorfzentrifuge
- Extinktion des Überstands messen bei 464 nm
Photometrische Bestimmung von Orthophosphat
Reagentien:
A) Molybdatschwefelsäurereagenz:
14.4 ml konz. H 2 SO 4 (d = 1.84) werden in 30 ml H 2 O dest. gelöst und nach dem Abkühlen
folgende Lösungen zugesetzt:
1 g Amidosulfonsäure in 10 ml H 2 O;
1.25 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 * 4 H 2 O in 20 ml H 2 O;
34.4 mg Kalium- antimontartrat in 10 ml H 2 O.
Es wird mit H 2 O dest. auf 100 ml aufgefüllt.
B) 1.0 g Ascorbinsäure in 10 ml H 2 O dest. Täglich frisch herstellen.
Vorgehen:
10 ml Wasserprobe (filtriert) werden im Reagenzglas mit 0.4 ml Reagenz A und 0.25 ml Reagenz
B versetzt. Nach mindestens 10 min wird die Absorption bei 865 nm Wellenlänge in 1 cm-
Küvetten gegen einen Reagenzienleerwert mit H 2 O gemessen.
Eichkurve:
Mit KH 2 PO 4 im Bereich von 0.2 - 40 µmol/l. Vergleichsweise auch Eichwerte mit 400 und 4000
µmol/l einsetzen.
Prinzip der Reaktion: Das Molybdän in der entstandenen Molybdato-phosphorsäure wird mit
Ascorbinsäure zu Mo(+IV) reduziert, das mit dem übrigen Mo(+VI) eine blaue Verbindung aus
gemischten Wertigkeitsstufen bildet.

Methodenskript AG Cypionka - 15 -
Proteinbestimmungen
1. Proteinbestimmung nach Lowry
Reagenzien:
• Kupferreagenz: 0.1 g CuSO 4 * 5 H 2 O in 20 ml 1%-iger K-Na-Tartratlösung lösen.
1 ml dieser Lösung mit 50 ml Na 2 CO 3 -Lösung (2%) vermischen. Die Lösung täglich frisch ansetzen.
• Folin-Reagenz: 1 Teil Folin-C.-Reagenz (Merck) mit 2 Teilen dest. Wasser mischen.
• NaOH: 0.3 M
Vorgehen:
10 ml Zellsuspension in der Kühlzentrifuge abzentrifugieren (6000g, 10 min) und einmal mit 0.6
%-iger Kochsalzlösung waschen. Das Sediment wird sorgfältig in Kochsalzlösung resuspendiert
und auf 10 ml aufgefüllt. In drei Proben von je 1 ml wird das Gesamtprotein nach LOWRY et al.
bestimmt.
Um die Zellen aufzuschließen, 1 ml Probe mit 0.50 ml 0.3 M NaOH versetzen und im Wasserbad
bei 60 °C in verschlossenem Reagenzglas während 90 min erhitzen. Nach dem Abkühlen 5 ml
Kupferreagenz unter ständigem Schütteln zufügen und 10 min im Dunkeln stehen lassen. Dann
wird 0.5 ml Folin-Reagenz zugesetzt, sofort geschüttelt und 30 min im Dunkeln gehalten. Dann
wird zentrifugiert (6000g, 10 min) und anschließend bei 623 nm gegen einen Blindwert photometriert
(d = 1cm). Mit Serumalbumin wird eine Eichkurve aufgestellt 10 - 200 µg pro Ansatz.
2. Proteinbestimmung nach Schmidt et.al. (1963)
(abgewandelte Biuretmethode nach La Riviére 1958)
Reagenzien:
(A) NaOH
(B) K-Na-Tartrat
NaOH
CuSO 4 * 5 H 2 O
KJ
in H 2 O
4 M (= 160 g/l)
5 g
4 g
1 g
2.5 g
400 ml
Vorgehen:
- 10 ml Zellsuspension mit 0.9 % NaCl waschen und abzentrifugieren
- Röhrchen mit 0.9 % NaCl auf 5 ml auffüllen
- 0.5 ml Reagenz A zugeben, schütteln
- genau 10 Minuten in kochendes Wasserbad (Glaskugeln auf die Reagenzgläser)
- sofort in kaltem Wasser abkühlen
- 2 ml Reagenz B zugeben, schütteln
- 30 Minuten in 37 °C Wasserbad
- Bei Trübung Partikel abzentrifugieren
- Extinktion bei 546 nm messen

Methodenskript AG Cypionka - 16 -
- Eichkurve mit BSA (Stammlösung: 50 mg/ml) im Bereich
von 0 bis 10 mg/Ansatz
3. Proteinbestimmung nach Bradford (1976)
Diese Proteinbestimmungsmethode beruht auf der Bindung von Coomassie Brilliant Blue G-250
an Protein. Die Bindung des Farbstoffs verursacht eine Verschiebung des Absorptionsmaximum
des Farbstoffes von 465 zu 595 nm. Es wird der Anstieg der Absorption bei 595 nm gemessen.
Dieser Test ist leicht reproduzierbar und schnell, weil schon nach 2 Minuten eine stabile Farbe
auftritt, die ihrerseits für eine Stunde stabil ist. Es besteht nur eine geringe oder keine Beeinträchtigung
durch Natrium- oder Kalium-Ionen, ebensowenig durch Kohlenhydrate, wie z.B. Saccharose.
Eine geringe Färbung entsteht bereits in der Gegenwart von alkalischer Puffer, jedoch kann der
Test genau durchgeführt werden, wenn entsprechende Pufferkontrollen gemacht werden. Die einzigen
Verbindungen, die eine starke Störung der Färbung im Test hervorrufen, sind relativ große
Mengen an Detergenzien, wie Natriumdodecylsulfat, Triton X-100 und handelsübliche Glaswarendetergentien.
Durch geeignete Kontrollen kann jedoch die Störung von geringen Mengen an
Detergentien ausgeglichen werden.
Coomassie Brilliant Blue G-250 kommt in zwei verschiedenen Farben vor, rot und blau. Die rote
Farbe wird nach der Bindung des Farbstoffs an das Protein in die blaue Farbe umgewandelt.
Reagenz: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 werden in 50 ml 95% Ethanol gelöst. Zu dieser
Lösung werden 100 ml 85% (w/v) Phosphorsäure gegeben. Diese Lösung wird dann auf 1
Liter aufgefüllt. Die Endkonzentration im Reagenz sind 0.01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-
250, 4.7% (w/v) Ethanol, und 8.5% (w/v) Phosphorsäure.
Standardmethode: Proteinlösungen, die 10 bis 100 µg Protein in 0.1 ml enthalten, werden in
12*100 mm-Reagenzgläser pipettiert. Das Volumen in den RG wird mit entsprechendem Puffer
auf 0.1 ml aufgefüllt. 5 ml Reagenz hinzugeben und mischen. Nach 2 Minuten und vor Ablauf
einer Stunde die Absorption bei 595 nm gegen den Leerwert messen.
Mikro-Test: Proteinlösungen, die 1 bis 10 µg Protein in einem Volumen von 0.1 ml enthalten,
werden sofort in Halbmikro- Küvetten pipettiert. Das Volumen wird entsprechend mit geeignetem
Puffer auf 0.1 ml aufgefüllt. 1 ml Reagenz wird zugegeben und gemischt. Die Absorption wird
ebenfalls bei 595 nm gegen die Referenz gemessen.
Eichkurven mit Rinderserumalbumin (BSA) in 0.15 M NaCl herstellen.

Methodenskript AG Cypionka - 17 -
Bestimmung der Trockenmasse von Bakterienkulturen
(nach Widdel, modifiziert nach Cypionka und Pfennig)
1. Wägegefäße (abgeschnittene Reagenzgläser mit etwa 3 ml Volumen) gründlich reinigen (am
Schluß nicht mehr mit den Fingern, sondern nur mit Pinzette berühren), in saubere kleine Alu-
Zylinder stellen und bei 80 °C trocknen. Es wird keine Eichkurve erstellt, jedoch sollte immer ein
leeres Gefäß als Reserve und zur Kontrolle der Wägungen parallel eingesetzt werden.
2. Sulfidhaltige Bakterienkulturen mit CO 2 durchperlen, um H 2 S auszutreiben, auf jeden Fall
Kultur gründlich homogenisieren, optische Dichte (bei 436 nm oder einer anderen Wellenlänge,
bei der keine spezifische Absorption gegeben ist) messen und notieren.
3. Ein genau bestimmtes (und notiertes!) Volumen (500 - 1000 ml) in 250 ml-Zentrifugenbechern
für mindestens 20 min zentrifugieren (12000 upm), austarieren mit dest. Wasser.
4. 300 ml Ammonium-Acetat-Puffer, etwa 50 mM, pH 6.5 (mit Essigsäure einstellen), herstellen.
Dieser Puffer verdampft bei Erhitzen vollständig als NH 3 und Essigsäure!
5. Sofort nach Stillstand der Zentrifuge Überstand vorsichtig absaugen, Zellen aus mehreren Bechern
in einem einzigen sammeln, in Ammonium-Acetat-Puffer waschen, erneut abzentrifugieren.
6. Die trockenen Wägegefäße auf der oberschaligen Waage vorwiegen, die auf Null geeichte
Analysenwaage entsprechend voreinstellen und Gefäße genau wiegen, Leergewicht notieren.
7. Sofort nach Stillstand der Zentrifuge Überstand absaugen, Zellen (behutsam!) in 0.5 ml dest.
Wasser mit Hilfe einer Pasteurpipette in das Wägegefäß überführen; mindestens zweimal mit 0.5
ml dest. Wasser nachspülen.
8. Bei 80 °C bis zur Gewichtskonstanz trocknen (ein bis zwei Tage).
9. Die abschließende Wägung muß unmittelbar nach Entnahme der Proben aus dem heißen
Trockenschrank erfolgen, da die Zellen Wasser absorbieren. Dazu Analysenwaage entsprechend
voreinstellen.
10. Wägegefäße gründlich reinigen! Trockenmasse pro OD-Einheit und Volumen ausrechnen.
Chromatographische Analyse der Carotinoide phototropher Bakterien
(nach Eichler und Pfennig)
a) Ernte der Bakterienmasse
Gut gewachsene Kulturen werden abzentrifugiert (9000 rpm, 20 min), das überstehende Kulturmedium
vorsichtig dekantiert und verworfen.

Methodenskript AG Cypionka - 18 -
b) Extraktion der Carotinoide
Carotinoide sind in Gegenwart von Luft und Licht unbeständig!
Extraktionsmittel: Ethanol abs.: Aceton = 1:1.
Das Pellet von a) wird in dem restlichen Überstand (evtl. 0,2 ml dest. Wasser zusetzen) resuspendiert
und vollständig in ein 10 ml-Zentrifugenglas überführt. Dann werden 8 ml Extraktionsmittel
zugegeben, gut durchgemischt und das Röhrchen nach Begasen mit N 2 mit einem Butylgummistopfen
verschlossen. Röhrchen etwa 1 Stunde bei Zimmertemperatur extrahieren lassen, nochmals
durchmischen und Zellreste abzentrifugieren; Gummistopfen vorher abnehmen, Tischzentrifuge,
15 min. Farbigen Überstand bei 25 °C im Rotationsverdampfer unter schwarzem Tuch einengen.
Farbigen Satz mit 0,75 ml Extraktionsmittel aufnehmen, in ein Röhrchen überführen, mit
N 2 begasen und mit Butylgummistopfen verschließen; im Dunkeln aufbewahren.
c) Chromatographie auf Dünnschicht-Platten
Laufmittel: Petroleumbenzin : Aceton = 9:1
Chromatographiekammer mit Fließpapier auslegen, mit N 2 begasen und schließen. Dann 100_ml
Laufmittel einfüllen und 1 h sättigen lassen. Den Extrakt von b) mit Hamilton-Spritze vorsichtig
auf die Startlinie einer Kieselgel-Dünnschicht-Platte unter einem N 2 -Strom zum Trocknen auftragen
(etwa 100 µl auf 3 cm Strecke auftragen, daneben etwa 50 µl auf 3 cm). Vergleichsextrakte
ebenso behandeln. Platte in der abgedunkelten Kammer entwickeln. Wenn Laufmittel etwa 16 cm
hoch gestiegen ist (mit Bleistift markieren), Platte kurz trocknen mit N 2 und nochmals entwickeln.
Dann Platte mit N 2 trocknen. Auf der trocknen Platte Banden mit Spatel vorsichtig markieren
(Laufhöhe!), Platte mit Glasplatte abdecken und möglichst rasch auf durchsichtige Folie und Papier
kopieren. Farben der Banden genau aufschreiben und anhand der Banden der Vergleichsorganismen
identifizieren.
Bestimmung der Bacteriochlorophylle a, c, d und e
(nach Oelze, bzw. Steenbergen und Korthals)
Bakterienkultur (2 bis 5 ml) wird über ein Glasfaserfilter (f 25 mm) bzw. (bei Stämmen mit besonders
kleinen Zellen) über Membranfilter (Porenweite 0,2 µm , f 2,5 cm) abfiltriert. Nach
Überführen in 3 ml Aceton wird im Dunkeln bei 4°C über Nacht extrahiert. Die Messung erfolgt
gegen reines Extraktionsmittel für Bchl a bei 771 nm Bchl c bei 663 nm Bchl d bei 652 nm Bchl e
bei 647 nm. Die Pigmentkonzentration errechnet sich nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz
E = c * d * ε
mit E = Extinktion am Absorptionsmaximum
c = Pigmentkonzentration
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)
ε = Extinktionskoeffizient am Absorptionsmaximum für
Bchl a = 92.3 ml * mg -1 * cm -1
Bchl c = 92.6 ml * mg -1 * cm -1
Bchl d = 98.0 ml * mg -1 * cm -1 (dito anzunehmen für Bchl e)

Methodenskript AG Cypionka - 19 -
Berechnung der Zellzahlen aus Most-Probable-Number (MPN)-
Verdünnungsreihen mit 3 Parallelen
(nach American Public Health Association)
Zur Bestimmung von Lebendzellzahlen mit der MPN-Technik werden die Proben in geeigneter
Nährlösung stufenweise (1:10) in drei parallelen Reihen verdünnt und die flüssigen Kulturen hinreichend
lange (1-4 [12] Wochen) bebrütet. Aus der Anzahl der bewachsenen Röhrchen kann
nach dem Auswachsen aus statistischen Tafeln der sog. MPN-Index (Anzahl Zellen/ml Probe)
abgelesen werden.
Bewachsene von MPN-Index Vertrauens grenzen (95%)
3 Röhrchen mit Zellen pro ml untere obere
100 µl 10 µl 1 µl
0 0 1 3

Methodenskript AG Cypionka - 20 -
Berechnung der Zellzahlen aus Kolonien in oder auf Agar mit verschiedenen
Verdünnungsstufen
(nach Cavalli-Sforza)
Σ i C i
x = ———
Σ i (n i *z i )
x
C 1 , C 2 , ... , C i
n 1 , n 2 , ... , n i
z 1 , z 2 , ... , z i
= mittlere Zellzahl im Beimpfungsvolumen
= Anzahl der auf den einzelnen Platten gezählten Kolonien
= Platten/Verdünnungsstufe
= Verdünnungen
Beispiel:
Verdünnung: 10 -6 : 303, 290, 285 Kolonien
" 10 -7 : 32, 21 "
Mittlere Zellzahl x = 931/(3*10 -6 + 2*10 -7 ) = 2.91*10 8
Herstellung von Agar-beschichteten Objektträgern für die Mikrophotographie
(nach Pfennig und Wagener)
- Agar waschen
2 g Difco Agar werden in ca. 500 ml H 2 O dest. 5 mal gewaschen, um den Agar von Staub und
kleinen Partikeln zu reinigen. Zum Waschen wird die Agarlösung 10 min. auf dem Magnetrührer
gerührt und dann ca. 20 min. stehen gelassen bis der Agar sich vollständig abgesetzt hat. Der
Überstand wird vorsichtig dekantiert und der Agar erneut mit destilliertem Wasser gewaschen.
Nach dem letzten Waschen wird die Suspension auf 100 ml mit H 2 O aufgefüllt (Endkonzentration
von 2 %). Diese Agarlösung wird 20 min. bei 120 °C autoklaviert.
- Beschichten der Objektträger
Sorgfältig gereinigte Objektträger werden mit Agar beschichtet. Dazu werden die Objektträger
auf eine horizontale Platte gelegt (diese ggf. mit Wasserwaage tarieren). Mit Hilfe zweier Infrarotlampen
werden die Objektträger erwärmt, um eine gleichmäßige Beschichtung zu erhalten. Die
autoklavierte Agarlösung wird in einem Wasserbad bei 45 °C gehalten. 2 ml Agarlösung werden
auf einem Objektträger vorsichtig verteilt. Dazu wird mit der Pipettenspitze eine Zickzack-Linie
von einem Ende des Objektträgers zum anderen gezogen. Dabei sorgfältig ein Herabfließen des
Agars vom Objektträger zu vermeiden. Die Agarobjektträger müssen einige Tage trocknen. Anschließend
sollten sie in einem geschlossenen Kasten staubfrei aufbewahrt werden.

Methodenskript AG Cypionka - 21 -
- Photographieren von Bakterien
Zur photographischen Darstellung sollten die Bakterienkulturen eine hohe Zelldichte aufweisen;
ist diese zu gering, wird die Zellsuspension durch Zentrifugation konzentriert. Drei Tropfen von
20, 22 und 25 µl werden mit einer 0.1 ml- oder 0.2 ml-Pipette auf den Agar-beschichteten Objektträger
pipettiert. Jeder Tropfen wird sofort mit einem Deckglas (18x18 mm) abgedeckt. Um
ein Verdunsten der Flüssigkeit zu verhindern, werden alle vier Seiten des Deckglases mit Paraffinlösung
abgedichtet. Dazu wird ein Metallspatel erhitzt, mit der flachen Seite in das Paraffin
eingetaucht und anschließend am Deckglasrand vorsichtig angesetzt.
Bestimmung des Gram-Typs
a) Färbung nach GRAM (Modifiziert nach Bartholomew)
1) Ausstrich der Bakterien aus frischer Kultur (schnellwüchsige Bakterien maximal 24 h alt) auf
sauberem Objektträger (oder Deckglas) herstellen und an der Luft trocknen lassen. Ausstrich fixieren
durch dreimaliges Ziehen durch die Flamme (nicht Pyrolysieren!). Auf demselben Objektträger
Vergleichsausstriche mit Referenzbakterien herstellen (mit einem Gram-negativen und einem
Gram-positiven Stamm).
2) Fixierte Bakterien 1 min mit Huckers Ammoniumoxalat-Kristallvioett-Lösung färben.
3) Farblösung ablaufen lassen, Ausstrich 5 sec mit fließendem Wasser waschen.
4) Kaliumjodid-Jodlösung 1 min einwirken lassen.
5) 5 sec mit fließendem Wasser abwaschen.
6) Differenzieren: 3 x je 1/2 min in 3 Töpfen n-Propanol entfärben.
7) 5 sec waschen
8) Ausstrich eventuell mit Wasser und Deckglas mikroskopieren, um Qualität zu prüfen
9) Eventuell Gegenfärbung 1 min mit Safranin. Farblösung ablaufen lassen und Ausstrich kurz
mit fließendem Wasser abwaschen.
10) Ausstrich trocknen, angefärbte Bakterien mit 10- oder 40- facher Vergrößerung suchen
und dann direkt mit Immersionsöl ohne Deckglas
im Hellfeld im Objektiv Ölimmersion, 100fache Vergr., bei offener Blende mikroskopieren.
11) Resultat mit Gram-negativen und Gram-positiven Referenzbakterien vergleichen.
b) Kalilauge-Test (nach Gregersen)
1 Tropfen einer 3%igen KOH-Lsg. wird auf einen Objektträger gebracht. Mit einer Impföse wird
Zellmaterial (Kolonie oder abzentrifugierte Zellen) in diesen Tropfen etwa 5 - 10 sec eingerührt.
Zieht man bei vorichtigem Anheben der Platinöse einen schleimigen Faden nach, handelt es sich
um Gram-negative Zellen. Beim Einrühren Gram-positiver Zellen in die KOH wird kein schleimiges
Material gebildet.

Methodenskript AG Cypionka - 22 -
Isolierung von Reinkulturen anaerober Bakterien aus Tiefagar-
Verdünnungsreihen
Herstellung sog. "Shake-Röhrchen":
In einen 300 ml-Erlenmeyerkolben 100 ml dest. Wasser geben und Wasserstand markieren. Gemahlenen
Agar (3.3 g) zusetzen, auffüllen und Suspension 10 min rühren. Danach Agar absetzen
lassen, Wasser vorsichtig dekantieren. Dieser Waschvorgang dient dazu, wachstumshemmende
Bestandteile und Hydrolyseprodukte zu entfernen, und wird fünfmal wiederholt. Anschließend auf
100 ml auffüllen und autoklavieren (5 min bei 120 °C).
AGAR-PIPETTEN SOFORT MIT HEIßEM WASSER SPÜLEN:
Nach dem Autoklavieren die 3%ige Agarlösung heiß halten (60-70 °C) und mit einer 10 ml-
Pipette in 3 ml-Portionen auf Reagenzgläser verteilen, die anschließend mit Wattestopfen verschlossen
und erneut autoklaviert werden (15 min). Mit Verdunstungsschutz können die Röhrchen
im Kühlraum einige Zeit gelagert werden.
Agarverdünnungsreihe
Benötigt werden:
• Pro Reihe 7 durchnumerierte und beschriftete Reagenzröhrchen mit je 3 ml 3%igem sterilem
Agar (vor dem Sterilisieren 5fach mit dest. Wasser gewaschen), mit Wattestopfen verschlossen.
• Sterile Gummistopfen, passend zu den Röhrchen
• 1 Wasserbad mit 42 °C
• 1 Wasserbad mit kaltem Wasser
• 1 Bunsenbrenner mit Dreifuß und Konservendose mit 4 cm Wasserstand
• 1 50 ml-Fläschchen mit komplettem Medium
• sterile Pipetten
Vorgehen:
• Das Fläschchen mit Medium im Wasserbad erwärmen (lange genug...)
• Den Agar in den Röhrchen durch Kochen verflüssigen.
• Die Röhrchen in das Wasserbad (42 °C) stellen, und je 6 ml warmes Medium zusetzen
• Die Wattestopfen gegen Gummistopfen austauschen.
• 1 Tropfen der Kultur in das 1. Röhrchen geben, einmal umschwenken
• 1 Tropfen in das zweite Röhrchen gießen, das erste Röhrchen in das kalte Wasserbad stellen
usw. (Das Röhrchen, aus dem gegossen wird, vorher außen abtrocknen, damit nicht Wassertropfen
ausverdünnt werden.)
• Möglichst zügig die Röhrchen mit N 2 /CO 2 (80/20) begasen und bei 28 °C inkubieren.
Im Agar gewachsene Einzelkolonien können mit ausgezogenen Pasteurpipetten ausgestochen,
mikroskopiert und zur Gewinnung von Reinkulturen erneut in Agar verdünnt werden.

Methodenskript AG Cypionka - 23 -
Geißelfärbung (nach Ryu)
Zunächst wird ein mikroskopisches Präparat einer Bakteriensuspension hergestellt. Sobald der
Großteil der Zellen angeheftet ist, wird die Färbelösung zu dem Präparat gegeben. Nach einer
Einwirkzeit von 5-15 min sollten die Geißeln sichtbar sein.
Lösung I: 5%-ige Phenollösung 10 ml
Tanninsäure
2 g
AlK(SO 4 ) 2 x 12 H 2 O, ges. Lösung
10 ml
Lösung II: ges. Lösung Kristallviolett (12 g/100 ml MeOH)
Färbelösung: Lsg.I : Lsg.II = 10 : 1
Katalase-Test
Reagenz: 5%ige H 2 O 2 -Lösung, aus 30%iger durch Verdünnen mit dest. H 2 O herstellen. Kühl
und dunkel lagern. Nicht mit den Händen berühren. Verunreinigungen (Staub, Metalle etc.) bewirken
Zersetzung; daher sauber handhaben.
Vorgehen:
Mit Impföse Bakterienmasse, möglichst aus dem Zentrum einer frischen Kolonie entnehmen und
auf einen sauberen Objektträger geben. Einen Tropfen der verdünnten H 2 O 2 -Lösung mit sauberer
Pasteur-Pipette darübergeben. Gasentwicklung (O 2 ) zeigt Katalase an. H 2 O 2 nicht direkt auf
dieAgarplatte geben, da sonst die Bakterien abgetötet und nicht mehr für weitere Überimpfungen
verwendet werden können!
Oxidase-Test
Reagenz:
H 2 O
Ascorbinsäure
Tetramethyl-p-phenylendiamin-HCl
100 ml
0.1 g
1.0 g
Vorsicht, carcinogen! Reagenz (wird gestellt, täglich frisch ansetzen!) nicht mit Händen berühren
und nichts verschütten! Benutzte Gefäße und Pipetten nicht liegen lassen, sondern gleich gut spülen!
Vorgehen:
Schmale Filterpapierstreifen (Cellulose) mit einigen Tropfen Reagenz tränken (nicht zu nass!).
Bakterienmasse aus einer Kolonie mit einer Impföse auf den Papierstreifen geben und (evtl. mit
abgerundetem Glasstab) verreiben. Blaufärbung zeigt Oxidaseaktivität. Vergleichspräparat mit E.
coli.

Methodenskript AG Cypionka - 24 -
Analyse des Substratspektrums aerober Bakterienisolate
Der Substrattest stellt den Mittelpunkt der physiologischen Charakterisierung von Bakterienisolaten
dar. Getestet wird das bakterielle Wachstum auf 59 verschiedenen Kohlenstoffverbindungen
(Angabe in Klammern = Endkonzentration in mM):
Komplexsubstrate: Pepton (0.05 %), Casamino Acids (0.05 %), Hefeextrakt (0.005 %)
Polymersubstrate: Cellulose (0.05%), Stärke (0.1 %), Chitin (0.05 %), Xylan (0.05 %), Laminarin
(0.05 %)
Disaccharide: Saccharose (5), Cellobiose (5), Maltose (5), Trehalose (5)
Monosaccharide: Arabinose (5), Rhamnose (5), Xylose (5), Fructose (5), Glucose (5),
Mannose (5),
Zuckerabkömmlinge: Mannitol (5), Gluconat (5), Glucosamin (5)
Carbonsäuren:
Formiat (5), Acetat (5), Propionat (1), Butyrat (2.5), Valerat (0.5), Capronat
(0.5), Caprylat (0.5), Crotonat (0.2)
Dicarbonsäuren: Malonat (5), Succinat (10), Fumarat (5), Malat (5), Tartrat (2)
Andere org. Säuren: Glycolat (5), Pyruvat (5), Lactat (10), 2-Ketoglutarat (5), Citrat (2)
Alkohole:
Methanol (2), Ethanol (5), Propanol (5), Butanol (5), Glycol (5), Glycerin
(5), Tween 80 (0.001 %)
Aminosäuren: Alanin (2), Arginin (2), Asparagin (2), Cystein (2), Glutamin (2), Isoleucin
(2), Phenylalanin (2), Tryptophan (2), Prolin (2)
Amine: Betain (2)
Aromaten: Benzoat (2), Salicylat (2)
Heterozyklen: Nicotinat (2)
Der Test wird in 200 µl-Mikrotiterplatten (siehe Schema) unter aseptischen Bedingungen angesetzt.
Dazu werden 140 µl Medium (s.o.), 40 µl Substratlösung (aus einer Masterplatte) und 20 µl
der Bakterienflüssigkultur in jedes „Well“ pipettiert und bei 20°C inkubiert. Es müssen eine zellfreie
und eine subtratfreie Kontrolle angesetzt werden!
WICHTIG: Zellen vor dem Überimpfen waschen, um den Eintrag von „fremden“ Substraten zu
verhindern! Dafür 1.5 ml der Flüssigkultur in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren, den Überstand
mit einer Pipette abnehmen und mit frischem Medium wieder auf 1.5 ml auffüllen. Alle Arbeitsschritte
werden in einer Sterilbank durchgeführt.
Die Auswertung erfolgt über die durch bakterielles Wachstum hervorgerufene Trübung bzw.
entstehende Bakterienpellets in den einzelnen Wells. Allerdings sollten Stichproben mikroskopisch
überprüft werden. WICHTIG: Es muss beachtet werden, dass einige der eingesetzten Substanzen
selbst eine Trübung hervorrufen!
Abb. Inkubationsschema für Substrattest
auf Mikrotiterplatten

Methodenskript AG Cypionka - 25 -
Aufnahme von Wachstumskurven
Wichtigster Parameter der Wachstumsversuche sind die Erträge pro umgesetzten Substrat. Diese
werden als Trockenmasse und Zellzahl dargetellt. Die Wachstumsrate einer Bakterienkultur wird
aus der Messung der optischen Dichte bestimmt. Diese wird mit dem Ratio/XR Turbidimeter von
HACH (Labor 2) gemessen. Um die OD auf Zelzahlen umrechnen zu können, wir an verdünnten
Proben die Zellzahl pro OD ermittelt. Gleichung zur Bestimmung der Wachstumsrate:
ln( x)
− ln( x0)
µ =
( t − t )
0
µ = Wachstumsrate (h -1 )
x = OD (aktueller Zeitpunkt)
x 0 = OD (zu Beginn des exponentiellen Wachstums)
t – t 0 = betrachteter Zeitraum (h)
Lithotrophes Wachstum soll mit den folgenden Substraten getestet werden.
Serumflaschen:
Gradientenröhrchen:
H 2 /O 2 (70/30, v/v), S 2 O 3 2- (5 mM)/ Luft, H 2 (100 %)/NO 3 - (10 mM)
HS - /O 2 (Stichkultur)
Schraubdeckelröhrchen: HS - (1 mM)/NO 3 - (10 mM), S 2 O 3 2- (5 mM)/NO 3 - (10 mM)
Bestimmung der b-Glucosidase-Aktivität
Die β-Glucosidase (= Cellulase) hydrolysiert die β(1,4)-glucosidische Bindung zwischen den Glucoseeinheiten
der Cellulose.
Testprinzip
Die in der Probe enthaltenen β-Glucosidasen hydrolysieren das nicht fluoreszierende Substratanalogon 4-
Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid. Das abgespaltene 4-Methylumbelliferon wird fluorimetrisch gemessen.
CH 3
CH 3
HOH 2 C
O
HOH 2 C
O
β-Glucosidase
+
HO
OH
HO
O
O
O
HO O O
HO
OH
HO
OH
4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid
4-Methylumbelliferon
β-D-Glucose

Methodenskript AG Cypionka - 26 -
Geräte
Spektrofluorophotometer
Reagenzgläser und Ständer
Vortexer
Magnetrührer
pH-Messgerät
Automatikpipetten
25°C Wasserbad
Zentrifuge
Reagenzien
4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid
4-Methylumbelliferon
Glycin
Natriumchlorid
Natriumhydroxid
Ethylenglykol-Monomethylether
Substratanalogon-Stammlösung
3 mg 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid in 0.5 ml Ethylenglykol-Monomethylether vollständig
lösen und 0.5 ml steriles bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche) zusetzen. Die Substratanalogon-
Lösung muss vor jedem Messtag frisch angesetzt werden.
Fluorophor-Stammlösung
10 mg 4-Methylumbelliferon in 5 ml Ethylenglykol-Monomethylether lösen und 5 ml steriles bidest.
H 2 O (in ausgeglühter Flasche) zusetzen. 100 µl dieser Lösung werden mit sterilem bidest.
H 2 O (in ausgeglühter Flasche) auf 100 ml aufgefüllt (Endkonzetration 1 µg/ml). Die Lösung ist im
Dunkeln bei 4°C lagerbar.
Glycinpuffer
0.75 g Glycin und 0.58 g Natriumchlorid in 100 ml sterilem bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche)
lösen. Der pH-Wert wird mit 1 M Natronlauge auf pH 10 eingestellt.
Versuchsdurchführung
Pro Probe werden 3 Parallelen angesetzt. 1 ml Probe plus 100 µl Substratanalogon-Lösung.
Blindwert: 1 ml steriles bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche) plus 100 µl Substratanalogon-Lösung.
Inkubation abgedeckt im Wasserbad bei 25°C für 2 h. Zum Abstoppen der Reaktion werden
jedem Ansatz 750 µl 0.1 M Glycinpuffer (pH 10) zugesetzt, gut durchmischt und sofort bei einer
Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 440 nm in Spektrofluorophotometer
gegen den Blindwert gemessen.
Bei hoher Eigenfluoreszenz der Probe wird ein Probenblindwert aus 1 ml Probe und 100 µl
sterilem bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche) angesetzt, genauso behandelt wie die Proben und
gegen einen fluorimetrischen Blindwert (3.3 ml steriles bidest. H 2 O) gemessen. Die Fluoreszenz
dieses Probenblindwertes wird von der Fluoreszenz der Probe subtrahiert.
Eichreihe
Für die den Test begleitende Eichreihe werden zwischen 10 und 70 µl MUF-Standardlösung zu
3.3 ml sterilem bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche) zugefügt. Dem Ansatz werden 750 µl
Glycinpuffer zugegeben, gut durchmischt und gegen einen Blindwert (3.3 ml steriles bidest. H 2 O
plus 750 µl Glycinpuffer) gemessen. Die Eichreihe muss bei jeder Messerie mitgemessen werden.
Die Aktivitätstests der β-Glucosaminidase, der Leucin-Aminopeptidase sowie der
β-Glucosidase im Mikrotiterplattentest werden wie oben beschrieben, mit einigen Änderungen,
durchgeführt.

Methodenskript AG Cypionka - 27 -
Bestimmung der b-Glucosaminidase-Aktivität
Die β-Glucosaminidase (= Chitinase) hydrolysiert die β(1,4)-glucosidische Bindung zwischen den
N-Acetyl-Glucosamineinheiten des Chitins.
Substratanalogon: 4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl-β-D-Glucosaminid
CH 3
CH 3
HOH 2 C
O
HOH 2 C
O
β-Glucosaminidase
+
HO
OH
HO
O
O
O
HO O O
HO
NH
C
CH 3
O
HO
NH
C
CH 3
O
4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl−β-D-Glucosaminid
4-Methylumbelliferon
N-Acetyl-β-D-Glucosamin
Bestimmung der Leucin-Aminopeptidase-Aktivität
Die Leucin-Aminopeptidase spaltet Pepton, welches ein Gemisch von Peptiden und Aminosäuren
aus tierischen oder pflanzlichen Proteinen ist.
Substratanalogon-Stammlösung
- Herstellung 100 ml einer 2 mM L-Leucin-7-Amido-4-Methylcoumarin-Lösung in sterilem bidest
H 2 O (in ausgeglühter Flasche; ausglühen: 12 h bei 180°C)
- Lagerung bei –20°C im Dunkeln möglich
- nach dem Auftauen Herstellung der benötigten Konzentrationen durch Verdünnung
Fluorophor-Stammlösung
- Herstellung 1 l einer 0.1 mM 7-Amino-4-Methylcoumarin-Lösung in 10 ml Ethylenglykol-
Monomethylether und 990 ml sterilem bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche)
- Lagerung als Teilmengen bei –20°C im Dunkeln
- nach dem Auftauen Herstellung der benötigten Konzentrationen durch Verdünnung
Ammonium-Glycin-Puffer
- Herstellung 1 l einer 0.2 M Ammoniumhydroxid / 0.05 M Glycin-Lösung in sterilem bidest. H 2 O
(in ausgeglühter Flasche); pH 10.5 mit 5 M Natronlauge einstellen
H 3 C H 2 N H O
H 3 CHCH 2 C C C
H
N
O
O
Leucin-Aminopeptidase
H 2 N
O
O
+
H 3 C H 2 N H
H 3 CHCH 2 C C
COOH
CH 3
CH 3
L-Leucin-7-Amido-4-Methylcoumarin
7-Amino-4-Methylcoumarin
L-Leucin

Methodenskript AG Cypionka - 28 -
Versuchsdurchführung
1 ml Probe plus 1 ml Substratanalogon-Lösung (zur Eichung 1 ml Probe plus 1ml Fluorophor
Lösung). Blindwert: 1 ml steriles bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche) plus 1 ml Substratanalogon-Lösung
(zur Eichung 1 ml Probe plus 1 ml steriles bidest. H 2 O).
Zum Abstoppen der Reaktion werden die Proben 3 min gekocht und auf 25°C abgekühlt. Danach
Zugabe von 1ml Ammonium-Glycin-Puffer, Sedimentation der groben Partikel, Überführung
des Überstandes und Zentrifugation 15 min 13000 rpm.
Bestimmung der b-Glucosidase-Aktivität in Mikrotiterplatten
Notwendige Geräte: Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten
Automatik-Mehrkanalpipette
Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader
Herstellung der Substratanalogon-Stammlösung in 10facher Menge.
Herstellung 1 l einer 0.14 M Natriumchloridlösung.
Versuchsdurchführung
Jeweils 200 µl Probe werden in drei Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert und mit 20 µl Substratanalogon-Lösung
versetzt. Für den Probenblindwert werden zu 20 µl Natriumchloridlösung
200 µl Probe pipettiert. Für den photometrischen Blindwert werden zu 200 µl Natriumchloridlösung
20 µl Substratanalogon-Lösung pipettiert. Die Mikrotiterplatten werden abgedeckt und bei
30 °C im Brutschrank 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wird der pH-Wert durch Zugabe von
50 µl Glycinpuffer auf pH 10 in den einzelnen Kavitäten eingestellt. Die Platten werden sofort in
einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer
Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen.
Eichreihe
Für die den Test begleitende Eichreihe werden zwischen 10 und 70 µl der MUF-Standardlösung
(mindestens drei Konzentrationsstufen) mit sterilem bidest. H 2 O (in ausgeglühter Flasche) auf 200
µl aufgefüllt und mit 20 µl Substratanalogon-Lösung versetzt. Die Eichreihe wird parallel zu jeder
Messreihe angesetzt und wie die Testansätze inkubiert. Auch hier wird nach der Inkubation der
pH-Wert durch Zugabe von 50 µl Glycinpuffer auf pH 10 in den einzelnen Kavitäten eingestellt.
Die Platten werden in einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader bei einer Anregungswellenlänge
von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen.
Bestimmung der Gesamtzellzahl
Als Standard-Methode zur direkten Zählung von Mikroorganismen wird heute eine Kombination
aus Membranfiltertechnik und Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Dabei werden die Mikroorganismen
vor oder nach der Filtration mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Acridinorange oder DAPI
(= 4´,6-Diamidino-2-phenylindol) gefärbt. Acridinorange bindet an die Phosphatgruppen von
Nucleinsäuren. Gefärbte Bakterien fluoreszieren grün, z.T. orange, Fremdpartikel rot, orange
oder gelb. DAPI reagiert mit doppelsträngiger DNA. Gefärbte Bakterien fluoreszieren blassblau,
Fremdpartikel gelb. Zur Filtration werden Membranfilter z.B. aus Polycarbonat oder anorganische
aus Aluminiumoxid (Anodisc) verwendet. Damit die Zellen nicht ins Innere der Filter eindringen,
sollte deren Porenweite maximal 0.2 µm betragen.

Methodenskript AG Cypionka - 29 -
Materialien
- Filtrieraufsatz (Millipore 20 mm Glasfilterhalter)
- 0.2 µm Anodisc-Filter (Whatman)
Chemikalien
- 0.5% TWEEN 80 (sterilfiltriert)
- 0.22 µm sterilfiltriertes ddH 2 O
- 0.22 µm sterilfiltrierter PBS-Puffer (130 mM NaCl, 5 mM NaH 2 PO 4 ; pH 7.2)
- Fixativ (4% Paraformaldehyd + 0.1% Triton X100in 1 x PBS; pH 7.25)
- DAPI-Lösung (10 µg/ml; sterilfiltriert)
- Einbettungsmittel DABCO (25 mg Diazabicyclo-octan + 1 ml PBS + 9 ml Glycerin)
- Färbelösung:
1ml Fixativ
+ 930 µl ddH 2 O (sterilfiltriert)
+ 70 µl DAPI-Lösung
Methode
Zu den mit Glutardialdehyd (6 ml, 3%) fixierten Sedimentproben 100 µl TWEEN 80 zugeben und
die Proben mit Ultraschall behandeln (5x5 sec). In ausgeglühten Reagenzgläsern 10 ml PBS-
Puffer vorlegen. Vorbehandelte Proben nochmals vortexen und 10 µl davon in den PBS-Puffer
überführen. Proben erneut vortexen und über mit Glasfaser-Filter (GF) unterlegte Anodisc-
Membranfilter filtrieren. Reagenzglas und Filtrieraufsatz mit sterilfiltriertem Wasser nachspülen.
Membran trockenfiltrieren und während des Vakuums abnehmen. Filtrieraufsatz vor jedem neuen
Filtrationsvorgang mit Spülmittel, ddH 2 O und steril filtriertem ddH 2 O säubern.
In einem kleinen Wägeschälchen DAPI-Lösung ansetzen. Filter mit der Probenseite nach oben
vorsichtig auf die Färbelösung auflegen und 5 min im Dunkeln färben. Filter(rückseite) auf Küchenpapier
im Dunkeln trocknen und danach auf einem Objektträger in DABCO einbetten, Deckglas
auflegen. Filter unterm Epifluoreszenzmikroskop auszählen.
Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe (nach Hobbie et al.)
2-5 ml einer Wasserprobe mit Bakterien werden in einem Reagenzglas mit ca. 200 µl einer partikelfreien
0.1% Acridin-Orange Lösung 2 min lang gefärbt und dann durch einen mit Irgalanschwarzlösung
(0.1%) vorgefärbten 0.2 µm Nucleporefilter abfiltriert. Als Unterlage kommt auf
den Filteruntersatz ein Cellulosemembranfilter. Der Nucleporefilter wird dann auf einem Objektträger
getrocknet, mit einem fluoreszenzfreien Immersionsöl (z.B. Siliconöl) versehen und mit
einem Deckglas bedeckt. Die Probe wird bei fluoreszenzfreier Ölimmersion unter dem Epifluoreszenzmikroskop
bei Blaulichtanregung betrachtet. Es werden pro Filter 10 Zählquadrate ausgezählt.
Die Probenmenge sollte so gewählt sein, dass pro Zählquadrat ca. 30-50 Bakterien sichtbar
sind Berechnung der Bakterienzahl/ml:
Zahl/ml = (y • A)/(a • V)
y: mittlere Zellzahl pro Zählquadrat
A: effektive Filtrationsfläche (µm 2 )
a: Zählquadratfläche (µm 2 )
V: Filtrationsvolumen (ml)

Methodenskript AG Cypionka - 30 -
ATP-Bestimmung (nach Bergmeyer)
Das Prinzip der ATP-Bestimmung mittels Luciferase-Assay beruht auf der Reaktion von ATP
mit Luciferin und Sauerstoff in Gegenwart des Enzyms Luciferase gemäß:
Luciferase
ATP + Luciferin + O 2 ⎯⎯⎯→ Oxyluciferin + AMP + PP i + CO 2 + Licht
Wenn die übrigen Reagenzien im Überschuß vorliegen, ist die Lichtemission proportional zur
ATP-Menge. In einem geeichten Meßsystem kann also von der gemessenen Lichtintensität auf
den ATP-Gehalt einer Probe geschlossen werden. Die Lichtemission wird in einem Luminometer
(LKB Wallac) bestimmt, das mit einem internen 14 C-Strahler auf die gewünschte Empfindlichkeit
eingestellt wird. Am Ausgang des Luminometers ist ein Schreiber angeschlossen, der die Meßwerte
in mV registriert.
Um den ATP-Gehalt von Zellen bestimmen zu können, müssen diese erst aufgeschlossen werden.
Extraktion des ATP (nach Blaut und Gottschalk 1984): 100 µl auf Eis gelagerte 3 M Perchlorsäure
wird in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß vorgelegt, 100 µl Probe zugegeben, einmal kurz
und dann jede halbe Stunde erneut geschüttelt. Nach 1½Stunden Extraktionszeit auf Eis werden
50 µl 1 M Tes-Puffer pH 7.4 und 112 µl 3 M KOH zugegeben, sodaß der pH-Wert zwischen
7.0 und 8.0 liegt. Die Kaliumkonzentration im neutralisierten Extrakt reicht aus, um das Perchlorat
auszufällen, das die ATP-Test-Reaktion stören würde. Die Ausfällung wird in einer Tischzentrifuge
kurz abzentrifugiert.
Luciferase-Assay:
Für den Luciferase-Assay werden folgende Chemikalien eingesetzt:
Tris-Puffer (EDTA-Tris-Acetat, pH 7.75):
Es werden 12.12 g Tris-(hydroxy-methyl)aminomethan und 0.74 g Na2-EDTA eingewogen, mit
destilliertem Wasser auf 900 ml aufgefüllt, der pH-Wert mit 2 M Essigsäure auf 7.75 eingestellt
und schließlich destilliertes Wasser bis auf 1000 ml Endvolumen dazugegeben.
Test-Reagenz:
Das Test-Teagenz (1243-102 Monitoring Kit) der Firma LKB enthält:
I.) Firefly-Luciferase
II.) D-Luciferin
III.) 50 mg Rinderserumalbumin
IV). 0.5 mmol Magnesiumacetat
V) 0.1 µmol anorganisches Pyrophosphat
Die gefriergetrocknete Testreagenz-Fertigmischung wird unter vorsichtigem Schütteln in 10 ml
Ultrapure-Wasser (durch Umkehrosmose hochgradig gereinigtes Wasser mit einer Leitfähigkeit
von 0.05-0.07 µS) gelöst, in Portionen zu je 1 ml in Cryo-Tubes gefüllt und in flüssigem Stickstoff
bis zu weiteren Verwendung aufbewahrt.

Methodenskript AG Cypionka - 31 -
ATP-Standard (0.5 µM):
30.26 mg ATP (ATP Na 2 H 2 * 3 H 2 O, Boehringer, Mannheim) werden ad 100 ml in Tris-Puffer
(siehe oben) gelöst und zu je 1 ml in Cryo-Tubes portioniert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
An jedem Versuchstag wird diese ATP-Stammlösung aufgetaut und in 3 Schritten insgesamt
1:1000 in Tris-Puffer verdünnt. Diese ATP-Standard-Lösung hat eine Konzentration von
0.5 µM i.e. 0.5 pmol/µl.
Durchführung der Messung:
160 µl Tris-puffer werden mit 40 µl Test-Reagenz in einer Polystyren Küvette durch langsames
Drehen gemischt und der Leerwert der Strahlung im Luminometer gemessen. Die Küvette wird
nun wieder herausgenommen, 10 µl Zellextrakt werden zugesetzt (resultierendes Volumen 210
µl), gemischt und wieder die Lichtemission ermittelt. Darauf wird die Messung zweimal durch
Zugabe von je 5 µl ATP-Standard (2.5 pmol) in dieselbe Küvette geeicht (resultierende Volumina:
215 µl und 220 µl). Durch diese interne Standardisierung werden Fehler, die durch die unterschiedlichen
Komponenten der einzelnen Proben verursacht werden können, ausgeschlossen.

Methodenskript AG Cypionka - 32 -
Isolierung von DNA
Einleitung
Nucleinsäuren können mit verschiedenen Methoden isoliert werden. Die gewählte Methode ist
abhängig von der Art der zu isolierenden Nucleinsäuren und ihrem späteren Verwendungszweck.
Einige einfache Verfahren beruhen auf einem enzymatischen (mit Lysozym) oder mechanischen
(mittels freeze and thaw, Beadbeater, Ultraschall) Aufschluß. Da man mit diesen Methoden i.d.R.
stark kontaminierte Nucleinsäuren erhält, können Reinigungsverfahren, wie z.B. Extraktionen mit
organischen Lösungsmitteln, angeschlossen werden.
Beim Zellaufschluß spielt die Herkunft der Proben eine große Rolle. Bakterienzellen aus Umweltproben
sind in einer Sedimentmatrix z.T. vor mechanischen Kräften und Enzymeinwirkungen
geschützt. In Kultur gewachsene Bakterien würden in einem Beadbeater zu großen Scherkräften
ausgesetzt. Neben diesen würde die Wärmeentwicklung zu einer Destabilisierung/Zerstörung der
Nucleinsäuren führen. In diesem Fall ist ein Aufschluß mittels freeze and thaw vorzuziehen, wobei
die Zellen durch plötzliches Einfrieren und Aufkochen physikalisch auseinandergebrochen werden.
Weiterhin ist zu beachten, daß dem mechanischen Aufschluß grampositiver Bakterien eine
Enyzmbehandlung mit z.B. Lysozym voranzustellen ist. Die Zellwand grampositiver Bakterien ist
mit 25 – 40 untereinander verknüpften Peptidoglycanlagen bis zu 10-mal dicker als die gramnegativer.
Ihre Zellwand ist mechanisch wesentlich stabiler, die Stabilität nimmt mit dem Verknüpfungsgrad
des Peptidoglycans zu. Mittels Lysozym kann die β-1,4-glykosidische Bindung zwischen
N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure, die abwechselnd miteinander verknüpft
das Rückgrat der Mureinstruktur bilden, gespalten werden.
Materialien
- Biozentrifuge
- Gefrierschrank (-70°C)
- Heizblock
Chemikalien
- Lysozym-Lösung (0,8 mg⋅ml -1 )
- 10 mM Tris-HCl, pH 8
- 10% SDS-Lösung (9,6 ml 20% SDS + 2,4 ml 0,5 M Natrium-Acetat (pH 7,5) + 66,4 ml
ddH 2 O; autoklavieren)
- 3 M Natrium-Acetatlösung
Methode
Die in Eppendorfcups bei –20°C eingefrorenen Proben werden aufgetaut und bei 19000 rpm
30 min bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen. Den Proben werden 100 µl Lysozym-Lösung
sowie 100 µl Tris-HCl zugesetzt. Die Proben werden zehnmal invertiert und anschließend
10 min auf Eis inkubiert. Danach werden 40 µl SDS-Mix und 60 µl Natrium-
Acetatlösung zugegeben und eine Stunde auf Eis inkubiert.
Für freeze and thaw werden die Proben in 5 Cyclen abwechselnd je 3 min bei –70°C eingefroren
und anschließend aufgekocht. Danach werden die Proben einer Phenol/Chloroform-Extraktion
unterzogen.

Methodenskript AG Cypionka - 33 -
DNA/RNA Extraktion aus Sedimentproben
Um in der PCR Nukleinsäuren als Template einsetzen zu können, ist es erforderlich sich diese erst
einmal zu beschaffen. Dabei spielt nicht nur der Aufschluss der Zellen eine entscheidende Rolle,
sondern auch die Aufreinigung und der Schutz der Nukleinsäuren vor DNasen und RNasen. Bei
Sedimentproben ist dabei ein Aufschluss der Bakterien durch „Freeze and Thaw“ (s. „Freeze and
Thaw“) meistens nicht möglich. Hierfür müssen stärkere Aufschlussmethoden verwendet werden,
da das Sediment den Bakterien einen Schutz bietet. Das Problem bei alternativen Aufschlussmechanismen
ist aber nicht der Aufschluss der Zellen, sondern der Schutz der Nukleinsäuren. So
können durch eine zu starke mechanische Beanspruchung die Nukleinsäuren dermaßen geschert
werden, dass eine weitere Untersuchung nicht mehr möglich ist. Zudem müssen die Nukleinsäuren
beim Aufschluss vor DNasen und RNasen geschützt werden, die beim Aufschluss der Bakterien
ebenfalls freigesetzt werden.
Eine Aufreinigung der Nukleinsäuren ist ebenfalls notwendig, da die extrahierten Proben je
nach Sediment sehr viele Huminsäuren oder andere für die PCR inhibierende Substanzen enthalten
können. Eine Aufreinigung kann mittels der Phenol/Chloroform Reinigung erfolgen. Ebenso ist es
möglich Nukleinsäuren über Kits aufzureinigen, was in der Regel Kostenaufwendiger und nicht
unbedingt effektiver ist.
Die Fällung der Nukleinsäuren dient abschließend dazu, die Nukleinsäuren in ein bestimmtes Volumen
und geeigneten Puffer aufzunehmen. Nach Abschluss der Extraktion und gegebenenfalls
einer Quantifizierung der Nukleinsäuren, steht einer Amplifikation mittels PCR/RT-PCR nichts
mehr im Wege.
Material
- Beadbeater
- Eppendorf-Reaktionsgefäß Ständer
- Sterile Kryroröhrchen + Deckel
- Kühlfalle
- Pumpe für die Speed Vac
- Speed Vac
- Sterile Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml und 2,0 ml)
- Sterile Zirkoniumperlen (∅ 0,1 mm)
- Tischzentrifuge (Biofuge 13 R)
- Wasserbad
- Zentrifuge (Biofuge 15 R)
Chemikalien und Lösungen
- Chloroform
- DEPC behandeltes ddH 2 O (0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) in ddH 2 O lösen und gut mischen.
Über Nacht bei 37 °C inkubieren und anschließend autoklavieren. DEPC löst sich vollständig
in CO 2 und Ethanol auf).
- DNase (1 U/µl)
- DNase-Puffer (pH 7,5) (40 mM Tris (Base), 6 mM MgCl 2 in ddH 2 O ansetzen, pH-Wert mit
HCl einstellen und autoklavieren)
- Ethanol (70 %)
- Fällungsmix (125 ml Ethanol (abs.), 5 ml Na-Acetat (3M))

Methodenskript AG Cypionka - 34 -
- Phenol -Wasser gesättigt- (pH 4,0 und 7,5)
- Phenol/Chloroform -Wasser gesättigt- (pH 4,0 und 7,5)
- SDS-Extraktions-Mix (9,6 ml 20 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 2,4 ml 0,5 M Na-Acetat
(pH 7,5) und 66,4 ml ddH 2 O in eine 100 ml Pfennigflasche pipettieren und autoklavieren)
- TE-Puffer (pH 8,0) (10 mM Tris (Base), 1 mM EDTA in ddH 2 O ansetzen, pH-Wert mit HCl
einstellen und autoklavieren)
- Sämtliche Lösungen sind mit DEPC behandeltes ddH 2 O angesetzt, um DNasen und RNasen
zu eliminieren
- Autoklaviert wird 20 min bei 121 °C
Zellaufschluss mittels Beadbeater
Je 1 g Sediment, 1 g Zirkoniumperlen und 1 ml SDS-Extraktions-Mix werden für jede Probe in
ein Kryroröhrchen überführt. In einem Beadbeater werden die Proben für 1 min geschüttelt (bei
ca. 5.000 rpm), 30 sec gewartet und eine weitere Minute geschüttelt. Das Sediment und die Zirkoniumperlen
werden in der Biofuge 15 R abzentrifugiert (5 min, 15.000 rpm). Der wässrige
Überstand wird in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gestellt (dabei
möglichst kein Sediment mit überführen). In das Kryroröhrchen werden 500 µl Phenol (pH 7,5)
hinzupipettiert und ein weiteres Mal dem Beadbeater und der Zentrifuge unterzogen. Der wässrige
Überstand wird mit dem Vorherigem vereinigt. Nun werden in das Kryroröhrchen 250 µl SDS-
Extraktions-Mix und 250 µl Phenol (pH 7,5) hinzugeführt und die Prozedur ein weiteres Mal
wiederholt.
Für eine kombinierte DNA/RNA Extraktion wird der Überstand, bevor er einer Phenol/Chloroform
Reinigung unterzogen wird, aufgeteilt.
Phenol/Chloroform Reinigung
Zu der aufzureinigenden Nukleinsäurelösung wird das einfache Volumen an Phenol (pH 4,0 für
RNA und pH 7,5 für DNA) hinzupipettiert. Nach einer Inversion (10 x) und einer Zentrifugation
(13.000 rpm, 2 min), wird die wässrige Phase (in der Regel der Überstand) in ein neues 1,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die organische Phase und die Interphase beinhalten die
Proteine und Huminsäuren die durch diese Reinigung entfernt werden sollen.
Zur wässrigen Phase wird nun das einfache Volumen an Phenol/Chloroform (pH 4,0 für RNA und
pH 7,5 für DNA) hinzupipettiert. Es folgt wieder eine Inversion und Zentrifugation (s.o.). Der
wässrige Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt (s.o.). Der Probe wird als letztes
das einfache Volumen an Chloroform zugegeben und die Probe erneut wie oben beschrieben behandelt.
Die nun erhaltene wässrige Lösung, mit den gereinigten Nukleinsäuren, wird in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt. In der anschließenden Ethanol-Fällung werden die, für die PCR,
störenden Salze entfernt und die Nukleinsäuren in einen geeigneten Puffer aufgenommen.
Ethanol-Fällung
Der Probe wird das 2,6-fache Volumen des Fällungsmixes (immer frisch ansetzen, da Na-Acetat
bei längerer Lagerung ausfällt) beigefügt und die Nukleinsäuren über Nacht bei - 20 °C
gefällt (alternativ 4 h bei 4 °C). Am nächsten Tag werden die gefällten Nukleinsäuren abzentrifugiert
(15.000 rpm, 30 min). Hierbei ist auf eine Ausrichtung der Eppendorf-Reaktionsgefäße zu

Methodenskript AG Cypionka - 35 -
achten, damit diese beim nächsten Zentrifugationsschritt ebenfalls in der gleichen Position zentrifugiert
werden. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und 500 µl 70 %iges Ethanol
auf die Proben zum Waschen gegeben. Es folgt eine erneute Zentrifugation (15.000 rpm, 10
min). Der Überstand wird verworfen und die Proben werden für 5 - 10 min in der Speed Vac
(Unterdruck wird durch eine Pumpe erreicht), bei einer mittleren Temperatureinstellung, zentrifugiert.
Hierdurch wird das restliche Ethanol entfernt. Mindestens 10 min vor Inbetriebnahme der
Speed Vac sollte die Kühlfalle angestellt werden, um die Pumpe vor Flüssigkeiten zu schützen.
Die Nukleinsäuren können nach Trocknung in 50 µl TE-Puffer aufgenommen werden. Nach einer
Inkubation von 30 min bei Zimmertemperatur können die Proben dann bei 4 °C für den Gebrauch
gelagert werden. Proben die längere Zeit nicht benötigt werden und dementsprechend gelagert
werden sollen, können wieder im Fällungsmix (2,6 fache Volumen) aufgenommen werden und bei
– 70 °C eingefroren werden.
RNA-Extraktion und DNase-Verdau
Um reine RNA zu erhalten ist es notwendig Kontaminationen durch DNA vorzubeugen und/oder
zu entfernen. Dies ist Notwendig, da in einer PCR zusätzlich vorhandene DNA mitamplifiziert
wird. Bei der Extraktion von RNA wird die Phenol/Chloroform Reinigung bei einem pH-Wert
von 4,0 durchgeführt. Bei diesem pH-Wert fällt ein Teil der DNA in der Interphase aus. Die RNA
löst sich dagegen weiterhin vollständig in der wässrigen Phase. Da nach der Extraktion, Reinigung
und der Fällung immer noch DNA in der Probe vorhanden ist, muss die Probe einem DNase-
Verdau unterzogen werden, um somit die letzten Spuren von DNA zu entfernen.
Dafür werden die RNA Proben nach der Ethanol-Fällung nicht in TE-Puffer aufgenommen, sondern
in 500 µl DNase-Puffer. Weiter werden 5 µl DNase hinzupipettiert und die Proben 60 min
bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Anschließend werden die Schritte ab der Phenol/Chloroform
Reinigung wiederholt (dient der Entfernung der DNase).
Um später nachzuweisen ob sich noch DNA in den RNA Proben befindet, werden die Proben in
einer PCR eingesetzt. Sollte sich in dieser PCR Nukleinsäuren amplifizieren lassen (RNA wird
nicht amplifiziert), ist die Probe noch mit DNA kontaminiert. Sollten keine Produkte zu erkennen
sein, kann man davon ausgehen, daß die Probe DNA frei ist.
Kurzdarstellung der kombinierten DNA/RNA Extraktion
- Aufschluss der Zellen im Sediment mittels Beadbeater
- Aufteilung der Proben in DNA und RNA Proben
- Phenol/Chloroform Reinigung (pH Werte beachten)
- Ethanol-Fällung
- Aufnahme der DNA in TE-Puffer
- DNase-Verdau mit den RNA Proben
- Phenol/Chloroform Reinigung (pH 4,0)
- Ethanol-Fällung
- Aufnahme der RNA in TE-Puffer

Methodenskript AG Cypionka - 36 -
Schnelltest zur Quantifizierung von DNA (Ethidiumbromid (EtBr)-
Platten Test)
Je 1 µl Probe wird auf eine EtBr-Platte pipettiert. (1,5 %iges Agarosegel in 1 x TAE Puffer ansetzen
und in der Mikrowelle aufkochen. Nach Abkühlung (auf ca. 60 °C) werden 15 µl Ethidiumbromid
(10 mg/ml) pro 100 ml Agarose hinzupipettiert und die Agarose in Petrischalen gegossen).
Zusätzlich werden je 1 µl Heringssperma in verschiedenen Konzentrationen (z.B. 10, 30, 50,
100, 150 ng/µl) aufgetragen. Unter einem Transiluminator kann der DNA-Gehalt an Hand des
Standards abgeschätzt werden.
Kurzdarstellung einer DNA-Extraktion mittels eines Kit von Bio-
Gene
Um Nukleinsäuren schnell zu extrahieren lohnt sich häufig der Einsatz eines Kits, da eine Extraktion
mit anschließender Phenol/Chloroformreinigung mindestens 2 Tage und länger dauern kann.
Zudem arbeiten Kits bei der Aufreinigung der Nukleinsäuren häufig mit Filtern, die somit den Einsatz
von giftigen Substanzen wie Phenol und Chloroform minimieren. Der Nachteil der Kits liegt
meistens bei den hohen Kosten.
Für die DNA-Extraktion wird ein Fast DNA-Extraktionskit for soil von BioGene verwendet.
Zusätzlich zu dem im Kit enthaltenen Säulen, Tubes und Chemikalien, werden pro Probe zwei
sterile 1,5 ml und ein 2 ml Reaktionsgefäß benötigt, sowie Ethanol und Na-Acetat. Wenn nicht
anders angegeben wird immer bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert.
- 0,5 g Sediment, 978 µl Sodium Phosphat Puffer und 122 µl MT-Puffer werden in ein Lysing
Matrix E Tube überführt
- Der Aufschluss der Zellen erfolgt durch einen Beadbeater (1 min bei 5000 rpm schütteln und
nach 30 sec warten erneut 1 min schütteln)
- Zentrifugieren (Kühlzentrifuge: 15.000 rpm, 15 min, 4 °C)
- Überstand in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß überführen und 250 µl PPS hinzupipettieren
- Die Probe 10 mal invertieren und 5 min zentrifugieren
- Überstand in ein steriles 2 ml Reaktionsgefäß überführen und mit 1 ml Binding Matrix Suspension
versetzen. Die Binding Matrix Suspension muss vorher gut gemischt werden.
- Probe 2 min von Hand schütteln und anschließend 3 min stehen lassen
- 500 µl vom Überstand verwerfen und 750 µl der resuspendierten Lösung auf einen Spin Filter
geben, 1 min zentrifugieren und Filtrat verwerfen
- Restliches Volumen der Probe auf den Spin Filter geben und erneut 1 min zentrifugieren
- Filtrat verwerfen und die DNA mit 500 µl SEWS-M von der Binding Matrix auf den Filter
waschen (Zentrifugation: 1min)
- Filtrat erneut verwerfen und 2 min zentrifugieren
- Spin Filter in ein neues Catch Tube stellen und 5 min unter der Cleanbench im geöffneten Zustand
trocknen lassen
- 50 µl DES auf den getrockneten Filter geben und 1 min zentrifugieren
Die DNA ist nun amplifikationsfertig. Da man in der Regel nicht die gesamten 50 µl benötigt,
können 30 µl in ein weiteres steriles 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt werden. Mit Zugabe
von 90 µl Ethanol/Na-Acetat (siehe Ethanol-Fällung) wird die DNA gefällt und bei - 70
°C eingefroren. Im denaturierten Zustand und eingefroren ist die DNA vor Einflüssen die die

Methodenskript AG Cypionka - 37 -
DNA abbauen könnte, gut geschützt. Für eine erneute Verwendung der DNA siehe das Protokoll
der Ethanol-Fällung.
Die restlichen 20 µl DNA dienen als Template in der PCR oder können für weitere molekularbiologische
Untersuchungen verwendet werden.
Protokoll zur DNA-Extraktion aus Wasserproben und Flüssigkulturen
Die Wasserproben wurden über einem 0,2 µm-Polycarbonat-Filter abfiltriert. Im Eppendorfgefäß
wurden dem Filter 0,5 g Zirkonium Perlen, 20 µl SDS 25%, 600 µl Phosphatpuffer und 600 µl
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zugesetzt. Um die Zellen aufzuschließen, und um Fremdstoffe
wie Verunreinigungen durch das Probenwasser, sowie Zellbestandteile von der vorhandenen
Bakterien-DNA zu entfernen wurde das Eppendorfgefäß drei Minuten gevortext, danach 10 min
bei 60°C in einem Wasserbad inkubiert und wieder drei Minuten lang gevortext. Die organische
Phenolphase der Probe wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei Raumtemperartur und
10.000 rpm von der wässrigen Phasen getrennt. Die DNA befand sich nun in der oberen, wässrigen
Phase, die in ein neues Eppendorfgefäß überführt wurde. Zur ursprünglichen Probe wurden
weitere 300 µl Phosphatpuffer zugegeben, erneut eine Minute gevortext und wie vorher 10 min
zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde zum ersten dazugegeben. Den Überständen wurde
nun wieder 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zugesetzt, um die restlichen Verunreinigungen
von der DNA zu entfernen. Nach wiederholtem Vortexen und Zentrifugation konnte wieder
der Überstand abgenommen und in ein neues Gefäß überführt werden. Sofern noch ein durch
Proteine verursachtes, weißes Präzipitat an der Interphase zu sehen war, wurde der Vorgang mit
erneuter Zugabe von 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol wiederholt.
Anschließend wurde die wässrige Lösung, in der sich die DNA befand, nach Hinzufügen von
30 µl Natriumacetat und 2,25 ml Isopropanol über Nacht gefällt. Am nächsten Tag konnte die
DNA der Lösung durch Zentrifugation bei 4°C und 13000 rpm für 30 min pelletiert werden. Der
Überstand wurde abpipettiert und das Pellet wurde mit 1,5 ml Ethanol (70%) gewaschen. Die
Lösung wurde wiederum unter gleichen Bedingungen 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen
und das DNA-Pellet für drei Minuten in der Speed Vac getrocknet. Die präzipitierte und
getrocknete DNA wurde in 50 µl PCR-Wasser aufgenommen und stand für weitere molekularbiologische
Untersuchungen zur Verfügung.
Quantifizierung von DNA mit Pico Green
Je 1 µl Probe werden in 899 µl TE-Puffer aufgenommen. Zur Quantifizierung werden zu jeder
Probe 100 µl Pico Green Reagenz (Pico Green 1:40 in TE-Puffer angesetzt) hinzupipettiert. Mittels
eines Blindwertes und eines Standards (Blindwert: 900 µl TE-Puffer + 100 µl Pico-Green
Reagenz; Standard: 899 µl TE-Puffer + 1 µl Heringssperma (100 ng/µl) + 100 µl Pico Green
Reagenz) kann der DNA Gehalt in der Probe bestimmt werden. Dabei werden die Proben in einem
Spektrofluorophotometer (Shimadzu) bei einer Extinktion von 460 nm und einer Emission
von 540 nm gemessen. Das Gerät liefert dabei Werte in ng/µl. Hierbei ist darauf zu achten, daß
der Standard nicht von 100 ng/µl abweichen sollte (im Ergebnis). Vor der Messung müssen die
einzelnen Proben nach Zugabe des Pico Green Reagenz gevortext und 5 Minuten dunkel inkubiert
werden.
Während der gesamten Messung ist mit Handschuhen und Kittel zu arbeiten. Die Abfälle werden
im Färbeabfall entsorgt.

Methodenskript AG Cypionka - 38 -
DNA-Quantifizierung am Microtiterplattenreader
Da für die Sequenzierung, Real-Time PCR und DGGE die genaue Menge an DNA bekannt sein
muss, ist es notwendig den DNA-Gehalt zu quantifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch einen
DNA-Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen (hiermit vorsichtig arbeiten, da der Farbstoff in jegliche
DNA interkalieren kann) und einem Fluoreszenzreader. Die Berechnung erfolgt durch eine Eichgerade
die mittels einer bestimmten DNA Konzentration erstellt wird.
1) Pipettierung DNA-Standards
DNA-Konzentration TE-Puffer
pH 7,5
DNA-Stammlösungen PicoGreen 1:200 verdünnt mit
TE-Puffer pH 7,5
100 ng/µl 99 µl 1 µl 100 µl
50 ng/µl 99 µl 1 µl 100 µl
25 ng/µl 99 µl 1 µl 100 µl
0 ng/µl 100 µl 0 µl 100 µl
2) Pipettierung DNA-Probe
TE-Puffer DNA-Probe
PicoGreen 1:200 verdünnt mit
pH 7,5
TE-Puffer pH 7,5
99 µl 1 µl 100 µl
è PicoGreen erst kurz vor der Messung dazu pipettieren
è Inkubation 5 min im Reader
1) Microtiterplattenreader anschalten
2) Computer anschalten
3) Programm FLUOstar Optima starten
4) Einloggen in das Program als „user“ und mit „Run“ bestättigen
5) in Menüleiste Setup -> Reader Configuration -> Fluorescence einstellen
6) Warnung wegklicken
7) am Reader die silbernen Kabel nach oben stellen
8) Button Test Protocols drücken
è Test name: Reinhard Versuch durch Doppelklick starten
è Einstellungen:
a) Basic Parameters
Test name: Reinhard Versuch
Microplate: Nunc F96 Microwell 96
Positioning delay: 0,1
No. of kinetic windows: 1
No. of cycles: 3
Measurement start time: 0,0
No. of flashes per cycle: 20
Cycle time: =Variable (abhängig von Probenanzahl)
x Fluorescence intensity
No. Of multichromatics: 1
Excitation filter: 485 nm
Emission filter: 520 nm
Gain: =Variable (abhängig von höchster DNA-Konzentration)
Start: 1

Methodenskript AG Cypionka - 39 -
Stop: 1
Pause before cycle: 0
b) Layout
Eintragung der Proben- und Standard-Anordnung auf der Platte
danach Button Check timing drücken (durchführen unter Menü Basic Parameters)
-> Festlegung der Cycle time
c) Concentrations/Volumes/Shaking
Nicht wichtig!
d) Injection/Timing
Nicht wichtig!
f) Timing Overview (One cycle)
9) Button Ampel anklicken -> Test name: Reinhard Versuchnklicken
è Einstellungen:
a) Plate IDs
ID1, ID2, ID3 Beschreibung des Laufs eintragen
z.B. ID1 DNA-Bestimmung
ID2 DGGE AB1
ID3 PCR AB30
No. Of executed runs since program start: (Zahl steigend)
b) Gain Adjustment
Required value: 90%
Excitation Emission Gain
485 520 =Variable
nach 4,5 min Inkubation mit PicoGreen S1 (=höchster DNA-Standard) markieren
und Button Gain Adjustment (well) klicken -> Gain-Berechnung
c) Sample IDs
Probenbezeichnungen eingeben
10) Starten der Messung durch anklicken des Buttons Start test run (nach 5 min)
11) Auswertung
Button Excel drücken -> Testname wählen -> Anzeige der Raw data
z.B. X1 0 0 0 für 485/520 nm
Datei öffnen C:\Reinhard\DNA-Bestimmung Berechnungstabelle.xls (bitte einen eigenen
Pfad anlegen und diese Datei nur kopieren)
Raw data und Evaluation 96 Angaben reinkopieren

Methodenskript AG Cypionka - 40 -
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Einleitung
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) lassen sich spezifische
DNA-Sequenzen gezielt vervielfältigen (amplifizieren). Dazu wird die doppelsträngige DNA im
ersten Schritt bei 94 - 96 °C zu DNA-Einzelsträngen aufgeschmolzen (Denaturierung). Das
Schmelzen der DNA ist Voraussetzung dafür, daß sich im zweiten Schritt spezifische Primer an
die DNA binden können (Annealing). Man benutzt dabei zwei unterschiedliche Primer, die dem 5'-
sowie dem 3'-Ende des zu amplifizierenden DNA-Segments entsprechen. Im dritten Schritt kann
eine thermostabile DNA-Polymerase (aus Thermus aquaticus, Taq-Pol.) von den Primern ausgehend
die DNA bei 72 °C replizieren (Elongation). Führt man diese drei Schritte viele Male hintereinander
aus, so verläuft die Amplifikation annähernd exponentiell (Faktor 1,6 – 1,8), da nicht nur
die Original-DNA, sondern auch deren Kopien vervielfältigt werden. Welche Bereiche der Proben-DNA
(Template) amplifiziert werden, läßt sich dabei durch die Wahl der Primer bestimmen.
So kann z.B. das bakterielle Gen für die 16S rRNA (d.h. die 16S rDNA) gezielt vermehrt werden.
Die RT-PCR wird verwendet um RNA amplifizieren zu können. So ist die Taq-Pol. nur in der
Lage, DNA zu replizieren. Um RNA (hier die 16S rRNA der Ribosomen) zu amplifizieren ist ein
zusätzlicher Schritt notwendig. Durch die Reverse Transcriptase (RT) wird die RNA in komplementäre
DNA (cDNA) umgeschrieben und kann anschließend durch die PCR amplifiziert werden.
Das Umschreiben der RNA in cDNA und die PCR werden bei einer RT-PCR hintereinander in
einem Arbeitsdurchgang durchgeführt. Alternativ kann man die gesamte extrahierte RNA durch
Zugabe einer Reversen Transcriptase in cDNA umschreiben (DNA ist stabiler als RNA) und diese
für weitere Untersuchungen genauso wie andere DNA-Proben behandeln.
Allgemeine Arbeitsanleitung für die PCR und RT-PCR
Die zur PCR/RT-PCR Amplifikation verwendeten Lösungen, Gefäße und Pipettenspitzen müssen
steril und DNA/RNA-frei sein (und bleiben!), da bei einer Kontamination durch Fremd-
DNA/RNA auch diese exponentiell vermehrt werden. Die Möglichkeit einer solchen Kontamination
muß immer durch eine DNA/RNA-freie Negativkontrolle, d.h. durch einen Ansatz ohne
DNA/RNA-Template, ausgeschlossen werden. Bei Verdacht auf Kontamination sofort den Betreuenden
benachrichtigen, um weiteren Schaden zu vermeiden. Zusätzlich ist es erforderlich immer
eine Positivkontrolle in einer PCR/RT-PCR einzusetzen (bekannte DNA/RNA) um die Funktionsweise
der PCR/RT-PCR zu kontrollieren. Zudem ist es erforderlich, dass sämtliche Lösungen
und Gefäße DNasen- und RNasen-frei sind, um ein Verdau der Nukleinsäuren im Reaktionsansatz
zu verhindern.

Methodenskript AG Cypionka - 41 -
Beispiel für einen PCR-Ansatz:
Lösung Menge [µl]
H 2 O (Ampuwa, sauberes PCR-Wasser) von Fresenius 35
10fach konz. PCR Puffer für RedTaq von Sigma 5
dNTP-Lösung (enthaltend je 2,5 Mm der vier
4
Desoxynucleosidtriphosphate)
Primer 1 (10 pmol/µl Stammlösung) 1
Primer 2 (10 pmol/µl Stammlösung) 1
BSA (10 mg/ml) 1
MgCl 2 (20 mM) 1
RedTaq-Polymerase von Sigma (1U/µl) 1
DNA (ca. 50 ng/µl) 1
Gesamtvolumen: 50
- Hat die DNA-Probe eine zu hohe Ausgangskonzentration, oder zu viele inhibierende Faktoren,
so muß sie zuvor mit PCR-Wasser entsprechend verdünnt werden.
- Der 10fach konzentrierte PCR-Puffer enthält 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KCl, 11 mM
MgCl 2 , 0,1 % (w/v) Gelatine.
- Die dNTP-Lösung wird aus 10 mM Stammlösungen der einzelnen Desoxynucleosidtriphosphate
(dATP, dCTP, dTTP, dGTP) im Verhältnis (1:1:1:1) hergestellt.
- Die Primer: (Als Beispiel ist hier nur ein Primerpaar angegeben)
16S rDNA-Amplifikation:
a) Primer GC357f (Universeller Eubakterien Primer) (Sequenz: 5'-CGC CCG CCG CGC CCC
GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')
b) Primer 907r (Universeller Primer) (Sequenz 5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3')
Zielsequenz für diese Primer ist ein 626 bp langes Fragment (auf E. coli bezogen) im 16S rRNA-
Gen des bakteriellen Genoms. Die GC-Klammer am 5'-Ende der Amplifikate wird benötigt, um
die DNA später in einem denaturierenden Gel (DGGE) auftrennen zu können.
- RedTaq DNA Polymerase: 1 Unit/µl in einem Puffer laut Beipackzettel.
Beispiel für einen RT-PCR-Ansatz:
Lösung Menge [µl]
H 2 O (RNase freies Wasser) von Qiagen 32
5fach konz. RT-PCR Puffer von Qiagen 10
RT-PCR dNTP-Lösung (enthaltend je 2.5 mM der vier
2
Desoxynucleosidtriphosphate) von Qiagen
Primer 1 (10 pmol/µl Stammlösung) 1
Primer 2 (10 pmol/µl Stammlösung) 1
BSA (10mg/ml) 1
RT-PCR Enzymmix (1U/µl) von Qiagen 2
RNA (ca. 50 ng/µl) 1
Gesamtvolumen: 50
- Hat die RNA-Probe eine zu hohe Ausgangskonzentration, oder zu viele inhibierende Faktoren,
so muß sie zuvor mit PCR-Wasser entsprechend verdünnt werden.
- Der 5fach konzentrierte RT-PCR-Puffer enthält Tris-HCl (pH 8,7), KCl, 12,5 mM MgCl 2 ,
0,01 % (w/v) Gelatine, (NH 4 ) 2 SO 4 , DTT.
- Die Primer: Es werden die gleichen Primer wie für die PCR verwendet.
- RT-PCR Enzymmix: Omniscript und Sensiscript Reverse Transcriptase und HotStarTaq DNA-
Polymerase in einem Puffer laut Beipackzettel.

Methodenskript AG Cypionka - 42 -
Sind mehrere PCR/RT-PCR-Ansätze geplant, so ist es arbeitsökonomisch, zunächst einen „Mastermix“
aus jenen Lösungen herzustellen, die bei allen Ansätzen gleich sind. Bei x Ansätzen wird
dazu die (x+1)-fache Menge der benötigten Lösungen in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß pipettiert und
dort gut gemischt. Dabei ist es erforderlich die RedTaq erst als letztes zum „Mastermix“ zu pipettieren
(Hilfreich ist, die Chemikalien in der Liste von oben nach unten hinzu zu pipettieren, um ein
durcheinander kommen zu vermeiden). Zur Amplifikation werden 49 µl des „Mastermixes“ für
jede Probe in ein 0,25 ml PCR-Reaktionsgefäße vorgelegt. 1 µl Template wird anschließend hinzupipettiert
und sämtliche PCR-Ansätze werden in einem PCR-Thermocycler automatisch amplifiziert.
Beispiele für Temperaturprogramme:
PCR: 16S-rDNA-Amplifikation
RT-PCR: 16S-rRNA-Amplifikation
1 Zyklus Denaturierung 96 °C, 4 min 1 Zyklus Reverse
Transcription
50 °C, 35 min
10 Zyklen Denaturierung 96 °C, 30 sec 1 Zyklen Denaturierung 96 °C, 4 min
Annealing 62 °C, 45 sec 10 Zyklen Denaturierung 96 °C, 30 sec
Elongation 72°C, 1 min Annealing 62 °C, 45 sec
20 - 30 Zyklen Denaturierung 96 °C, 30 sec Elongation 70 °C, 1 min
Annealing 57 °C, 45 sec 20 – 30 Zyklen Denaturierung 96 °C, 30 sec
Elongation 72 °C, 1 min Annealing 57 °C, 45 sec
Elongation
70 °C, 1 min
Die PCR-Technik, bei der im zweiten Teil eine niedrigere Annealing-Temperatur gewählt wird, heißt Stepdown
oder Two-step PCR.
Die Temperatur wird abschließend für 10 min auf 72 °C gehalten, damit im letzten Zyklus frühzeitig
abgebrochene Strangsynthesereaktionen beendet werden können.
Danach werden die Ansätze bei 4 °C gekühlt.
Nach beendeter PCR/RT-PCR-Reaktion werden die Amplifikate auf einem Agarosegel analysiert oder zur späteren
Analyse bei + 4 °C kühl gelagert.
Agarose-Gelelektrophorese
Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese lassen sich DNA-Fragmente von 200 bp bis 50.000 bp
Länge voneinander trennen. Dazu wird die DNA in ein Agarose-Gel eingebracht und ein elektrisches
Feld angelegt. Aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen wandert die DNA durch
die Poren des Gels in Richtung der Anode (+), wobei kleinere Fragmente aufgrund ihrer geringeren
Reibung schneller wandern als große Fragmente (die Wanderungsgeschwindigkeit sinkt logarithmisch
mit der Zahl der Basenpaare). Nach Abschluß der Gelelektrophorese lassen sich die
getrennten DNA-Fragmente in dem Gel durch Anfärben mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff
(hier Ethidiumbromid) als Bandenmuster sichtbar machen.
1) Herstellung von Agarose-Gelen
Agarose-Gele werden in speziellen Plexiglas-Wannen gegossen. Die Wannen haben an zwei
einander gegenüberliegenden Enden keine Seitenwände, damit das Gel später nicht vom

Methodenskript AG Cypionka - 43 -
elektrischen Feld isoliert wird. Um das Gel gießen zu können, müssen diese Seiten daher zunächst
mit einem Klebestreifen zugeklebt werden.
Es werden 1,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer 1 facher Stärke gegeben (1 x TAE-Puffer: 40 mM
Tris(hydroxymethyl)aminomethan; 1 mM EDTA, pH 7,4 eingestellt mit Acetat). Für ein
Standard-Gel benötigt man 0,6 g Agarose in 40 ml Puffer. Die Agarose wird in einer Mikrowelle
so lange erhitzt, bis eine klare, schlierenfreie Lösung entstanden ist. Diese wird anschließend heiß
in die vorbereitete Wanne gegossen. Anschließend wird über ein Ende und in der Mitte der Wanne
ein Kunststoffkamm gehängt, und zwar so, daß dessen Zähne einen Abstand von ca. 1 mm
(Schichtdicke eines Objekträgers) zum Wannenboden haben. Auf diese Weise bekommt das
fertige Gel an einem Ende und in der Mitte kleine Taschen die der Aufnahme der PCR-
Amplifikate dienen. Nach etwa 20 min ist das Gel erstarrt und die Kämme können vorsichtig (!)
herausgezogen werden. Zum Schluß werden die Klebebandstreifen entfernt. Wird das Gel nicht
sofort benutzt, so muß es in einem mit 1 x TAE-Puffer gefüllten, geschlossenem Behälter vor dem
Austrocknen geschützt werden.
2.) Elektrophorese
Die Wanne mit dem Gel wird in eine Elektrophorese-Kammer gestellt (die offenen Enden in
Feldrichtung). Anschließend wird die Elektrophorese-Kammer so hoch mit 1 x TAE-Puffer
gefüllt, daß das Gel vollständig eintaucht.
Für PCR-Produkte die nicht mit der RedTaq erstellt wurden wird auf einem Stück Parafilm
1 µl-Tropfen Loading-Puffer 6 facher Stärke vorgelegt (6 x Loading-Puffer: 0,25% (w/v)
Bromphenolblau; 40 % (v/v) Glyzerin in 1 x TAE). Je 5 µl DNA-Probe werden mit je einem
Tropfen Loading-Puffer gemischt, indem mit einer Pipette mehrfach hoch und runter gesogen
wird. Anschließend wird jede Probe vorsichtig, präzise und luftblasenfrei in eine leere Tasche des
Gels pipettiert. Von PCR-Produkten die mittels der RedTaq amplifiziert wurden, werden 5 µl
ohne weitere Zugabe eines Loading-Puffers in die Kammern des Gels pipettiert. Die RedTaq
enthält einen Loading-Puffer der das sofortige Auftragen aufs Gel ermöglicht. Als Standard wird
eine 100 bp Ladder verwendet (Konz. 125 ng/µl), die schon mit einem Loading-Puffer versehen
ist. Vom Standard werden jeweils 5 µl auf das Gel aufgetragen.

Methodenskript AG Cypionka - 44 -
Abschließend wird eine Spannungsquelle an die Kontakte der Elektrophorese-Kammer
angeschlossen (korrekte Polung beachten!). Die sich anschließende Elektrophorese erfolgt bei
100 V für 40 min (wahlweise 90 V für 45 min).
Nach dem Ende der Elektrophorese wird das Gel in einen mit Ethidiumbromid in 1 x TAE-Puffer
(0,8 µg/ml Endkonzentration des Ethidiumbromids) gefüllten, vor Licht geschützten,
geschlossenen Behälter überführt und auf einem Schüttler für 20 min gefärbt.
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Achtung: Ethidiumbromid ist ein in die DNA interkalierender Fluoreszenzfarbstoff. Es unterscheidet dabei nicht
zwischen der Proben-DNA und der DNA unachtsamer Experimentatoren, wo es karzinogen wirkt. Beim Umgang
mit Ethidiumbromid ist daher Bedacht angesagt und Handschuhe und Kittel selbstverständlich!
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Nach dem Färben wird das Gel mit Hilfe einer Plastikzange in ein geschlossenen Behälter mit
ddH 2 O überführt. Anschließend wird das Gel auf einen Transiluminator im UV-Licht betrachtet
und zur Dokumentation mit einer Digitalkamera fotographiert und digital gespeichert.
Aufreinigung von PCR-Produkten
Die PCR-Produkte werden mit dem Purification Kit der Firma Qiagen und einer Tischzentrifuge
aufgereinigt: Das PCR-Produkt wird mit 5 Volumina PB-Puffer versetzt und auf eine QIAquick-
Säule gegeben. Dann wird bei Raumtemperatur für 1 min zentrifugiert (13000 rpm). Der Durchfluß
wird verworfen und die Säule mit 750 µl PE-Puffer gewaschen; anschließend für 1 min abzentrifugieren
(13000 rpm). Dieser Durchfluß wird ebenfalls verworfen und die Säule eine weitere
Minute bei 13000 rpm zentrifugiert. Die QIAquick-Säule wird danach in ein steriles 1,5 ml-Cap
gestellt. Die aufgereinigte DNA wird durch Zugabe von 30 - 50 µl EB-Puffer (direkt auf das
Zentrum der Membran geben und 1 min inkubieren lassen) von der Membran der Säule gelöst
(Mit dem MinElute Kit von Qiagen kann das PCR-Produkt auf 10 – 30 µl eingeengt werden). Die
Aufreinigung bei der Sequenzierung wird mit PCR-Wasser anstatt EB-Puffer durchgeführt. Durch
eine weitere Zentrifugation (13000 rpm, 1 min) wird die DNA eluiert.

Methodenskript AG Cypionka - 45 -
DNA-Sequenzierung nach Sanger (Kettenabbruch-Methode) am
LiCor DNA Sequencing System 4200 von MWG Biotech
Einleitung
Eine Sequenzierreaktion nach Sanger ist im Prinzip eine PCR mit nur einem Primer. Da hier
ebenfalls mit verschiedenen Temperaturzyklen gearbeitet wird spricht man auch von (engl.) „Cycle
Sequencing“. Die Entschlüsselung einer einzelnen Sequenz erfordert die Verwendung von vier
verschiedenen Ansätzen, bei denen jeder ein anderes Didesoxynukleotid (ddNTP) als „Abbruchnukleotid“
enthält. Die Didesoxynukleotide sind zu 3% der „normalen“ dNTPs im Reaktionsansatz
enthalten. Es gibt also je einen Ansatz mit einem Anteil an ddATP, ddGTP, ddCTP,
oder ddTTP. Die ddNTPs werden von der DNA-Polymerase wie die normalen dNTPs eingebaut,
führen jedoch, da ihnen die OH-Gruppe am 3´-Ende fehlt, zu einem Kettenabbruch. Nach einer
statischen Verteilung des Einbaus der ddNTPs, erhält man somit in jeder Reaktion ein Gemisch
verschieden langer DNA-Fragmente, die alle auf ein bestimmtes Nukleotid enden (im Ansatz mit
ddATP also auf A).
Die vier Ansätze werden nebeneinander auf ein Gel aufgetragen und das Gemisch der DNA-
Fragmente elektrophoretisch ihrer Größe nach getrennt (kurze Fragmente laufen schneller als lange
Fragmente). Die Verwendung eines fluoreszierenden Primers ermöglicht die computergesteuerte
Detektion der DNA-Banden über einen Laser, der ähnlich wie ein Scanner über das Gel läuft.
Die an ihm vorbeilaufenden Banden werden zur Fluoreszenz angeregt und können somit detektiert
werden. Das Ergebnis wird an einen Computer weitergeleitet und in ein Bild des Gels übersetzt.
Ein Vergleich der Lauflängen der Banden aus den vier Ansätzen führt zur Aufdeckung der unbekannten
Sequenz. Der schematische Ablauf einer Sequenzierungsreaktion ist in der nachfolgenden
Abbildung dargestellt.
Die Sequenz kann über das Internet an eine Datenbank (Bsp. EMBL, RDP) übermittelt werden,
wo ein Vergleich mit dort abgelegten Sequenzen erfolgt. Als Ergebnis erhält man die prozentuale
Ähnlichkeit zu bekannten Sequenzen.
Material
Geräte:
Thermocycler
LiCor DNA Sequencing System 4200 (incl. Zubehör)
Chemikalien und Reagenzien:
DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit (Amersham)
Sequenzierprimer (IRD-markiert)
Stammlösungen:
TBE-Puffer (10 ×)
Tris Base (890 mM) 108 g
Boric Acid (890 mM) 55 g
Na 2 EDTA × 2H 2 0 (20mM) 7,44 g
H 2 0 (dest.) ad. 1 l

Methodenskript AG Cypionka - 46 -
Arbeitslösungen:
Gellösung:
dest Wasser
14,5 ml
Urea NF
12,6 g
10x TBE-Buffer
3,6 ml
sorgfältig rühren bis der Harnstoff gelöst ist
"Long Ranger 50% gel solution" 3,6 ml
Sequenzierung
nach Sanger
5´
3´
unbekannte Sequenz
bekannte
Sequenz 3´
5´
Sequenzier-
Primer
fluoreszenz -
markiert
T
T
G
A
A
C
A
G
C
C
T
G
A
C
G
C
Sequenzier-Reaktion in 4 Ansätzen
(Puffer, Polymerase, MgCl 2 , dNTPs)
+ je 3%
ddGTP
ddTTP
ddCTP
ddATP
16 bp
15 bp
6 bp
Sequenziergel
Sequenzier-Ansatz mit ddATP
Primeranlagerung
T T G A A C A G C C T G A C G C
T G C G
Primer
Einbau eines ddATP
T T G A A C A G C C T G A C G C
A C T G C G
Kettenabbruch, Fragmentlänge = 6 bp
Einbau eines ddATP
A C T T G T C G G A C T G C G
Kettenabbruch, Fragmentlänge = 15 bp
Einbau eines ddATP
A A C T T G T C G G A C T G C G
Kettenabbruch, Fragmentlänge = 16 bp
Abb. Schematische Darstellung der Sequenzierung nach Sanger.

Methodenskript AG Cypionka - 47 -
Durchführung
Sequenzierreaktion
Die Sequenzierreaktion erfolgt mit dem DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit der Firma Amersham.
Für die zu sequenzierende Probe werden vier 0,2 ml-Caps für die vier Nukleotide G, A, T,
C verwendet (G = gelb, A = grün, T = rot, C = blau). Die zu sequenzierenden DNA-Probe (je 2
µl) wird in jedes der vier Caps pipettiert. Anschliessend wird ein Mastermix vorbereitet. Pro Probe
werden ddNTPs (1µl) und die IRD-Primer-Lösung (2 µl; 1pmol/µl) zusammenpipettiert (>10
Proben n+2;

Methodenskript AG Cypionka - 48 -
Einbau des Gel-Sandwiches:
Nach der Polymerisierung wird der Vorkamm vorsichtig herausgezogen und der obere Rand des
Gels von Acrylamidresten gereinigt. Die Platten werden im Bereich des Detektors nocheinmal
gründlich mit Ethanol gesäubert. Am fertigen Gel-Sandwich wird die obere Pufferkammer angebracht
und das Ganze in das Sequenziergerät mit der unteren Pufferkammer eingesetzt. In beide
Kammern wird TBE-Puffer (1 ×) bis zur "Max."-Markierung eingefüllt (insges. etwa 1 Liter) und
die Geltasche mit Hilfe einer Spritze mit Puffer gespült. Schließlich werden Deckel und Elektrokabel
angebracht, wobei darauf geachtet werden muss, daß die Platin-Drähte nicht berührt und
zerrissen werden! Weitere Informationen stehen im Handbuch DNA Sequencing and Genetic
Analysis Manual, Kapitel Gel Preparation and Electrophoresis.
Steuerung der Elektrophorese:
Die Steuerung des Sequenziergeräts erfolgt über den angeschlossenen Computer. Die Einstellungen
sind dem DNA Analysis Systems Training Manual entnommen. Unterstrichene Begriffe beschreiben
anzuwählende Programme, Optionen oder Keybordtasten:
Der Vorgang beginnt mit dem benennen des files über: Base Image IRV, Data Collection, File,
New (z. B. FP02, etc.). Über Scanner Control werden die Betriebsdaten überprüft. Soll-Daten
sind gelb unterlegt, links daneben stehen die Ist-Werte im Gel. Wenn alle Vorgaben geprüft sind,
scan status on und high voltage status on. Dann unter Parameters send anklicken. So wird die
Verbindung von Rechner zu Sequencer hergestellt. Jetzt muß die rote Leuchtschrift am Sockel
des Sequenzierers aufleuchten. Zur Equilibrierung des Gels erfolgt zunächst ein Vorlauf ohne
Proben (etwa eine Stunde).
Einstellungen des Sequenzierers für die Elektrophorese:
Spannung 1500 V
Stromstärke 35 mA
Leistung 45 Watt
Temperatur 50°C
Motor speed 2
Signal Channel 2
Rahmen/Frames 25
Wenn der Vorlauf beendet ist können über Options mit Auto Gain die Backround-Noise-Daten
überprüft werden. Danach werden die Autofunktion ausgewählt. Über Options und Focus die
Lasereinstellung optimieren und Autofunktion wählen. Danach wieder über Options Auto Gain
durchführen und erneut Autofunktion wählen. Über Options mit Cross Sections muß sich dann
folgendes Bild ergeben:
Dunkelgrau
Mittelgrau
Hellgrau
Mittelgrau
Dunkelgrau
Nach erneutem Autofunktion wählen muß das Gel in 25 Leserahmen (frames) eingeteilt sein.
Beladen des Gels:
Nach der Beendigung des Vorlaufs wird die Elektrophorese gestoppt und über view und delete
image die Daten der Vorlaufzeit gelöscht und über image Notpad (eigenes Icon) ausgefüllt. Der
Deckel des oberen Puffertanks wird abgenommen und die Geltasche erneut gespült. Danach wird
der Haifischzahn-Kamm (64-sharkstooth-comb) eingesetzt, so dass sich die abgeschnittenen Zäh-

Methodenskript AG Cypionka - 49 -
ne an beiden Seiten des Kamms auf Höhe der vorderen Glasplatte befinden (die Spitzen der anderen
Zähne berühren dann gerade die obere Seite des Gels). Vor dem Auftragen werden schließlich
alle Proben im Thermocycler denaturiert (70°C, 3-5 min), sofort auf Eis gestellt und erst dann mit
einer speziellen Spritze (8-channel-Hamilton syringe) aufgetragen (nicht mehr als 0,8 µl Probe
pro Tasche). Nun den Deckel des Puffertanks wieder aufsetzen und die Elektrophorese fortsetzen.
Der Lauf erfolgt über Nacht und dauert je nach Länge der zu sequenzierenden Fragmente etwa 5 -
10 Stunden. Die erzeugte Datei wird automatisch gespeichert. Das Programm Data Collection
kann somit einfach beendet werden.
Auswertung des Gels:
Die Auswertung der Proben erfolgt am selben Computer (Software LI-COR 4200), nach den
Vorgaben des DNA Analysis Systems Training Manual über das Programm: Image Analysis. Falls
die Sequenzier-Elektrophorese noch läuft, kann man per Alt und Tab-Taste zum Ausgangsmenü
wechseln, ohne die Sequnezierung abzubrechen und dort das Program Image Analysis anklicken.
Über File und Open Image kann die entsprechende Datei ausgewählt werden. Danach Image Notepad
(eigenes Icon) anklicken, um am Ende des Notpads die Auflistung der Probennummern und
ihre zugehörigen Geltaschen zu ermitteln. Unbedingt notieren: Gegenüberstellung file-name zu
Primer-Probencodierung. Jedes Gelspurquartett erhält einen eigenen Filenamen durch Vergabe
von Buchstaben. Buchstabe m für Spur 1-4, auf der eine bestimmte DNA mit einem bestimmten
Primer läuft; Buchstabe n für Spur 5-8, auf der eine andere DNA mit einem anderen Primer läuft
etc. (Buchstabe j auslassen wegen Verwechselungsgefahr!). Unter Enhancement können Kontrast
(s.u.) und Helligkeit verändert werden. Unter Sequence über Lane Definition werden jeder Gelspur
die aufgetragene Base so zugeordnet, wie sie aufgetragen wurden, also ACGT. Die Zuordnung
erfolgt wie im folgenden Beispiel:
Doppelklick z. B. auf A mit der linken Maustaste; halten und die entstehende Linie an den linken
Rand der A-Spur schieben und loslassen (Definition des linken Randes). Dann links dieser
Linie wieder linke Maustaste betätigen, halten, verschieben bis zum rechten Rand der A-Spur,
loslassen. (Definition des rechen Randes). Damit ist Spur A fertig definiert und kann per OK bestätigt
werden. Achtung: Bei reverse Primern ist die A-Probe mit T zu benennen usw.! Weiter ist
noch folgendes zu beachten:
Unter Sequence über Band Spacing kontrollieren, ob die vorgegebenen Linienmitten durch die
einzelnen Banden gehen; ansonsten entsprechend verändern. Unter Enhancement über Background
Substraction oder Bands Kontrast optimieren.
Unter Sequence kann nun semi-automatisches Sequenzieren gewählt werden. Die Bestätigung
der vom Rechner vorgeschlagenen Banden erfolgt per Doppelklick mit der linken Maustaste. Falls
zweifelhaft mit rechter Taste klicken, eine Korrektur erfolgt mit Backspace. Für Basen die der
Computer nicht eindeutig identifizieren kann, werden bestimmte Platzhalter gesetzt, die für bestimmte
Kombinationen von Basen (sog. Ambiguities, Mehrdeutigkeiten) stehen. Die Nomenklatur
nach IUPAC ist in der unteren Tabelle angegeben. Die Speicherung der Sequencen erfolgt
unter File mit Save as...Path ist z.B. DNA4000/DATA/FPRAKT. Der File lautet z.B. FP02i. Filenamen
eingeben! Er wird dann auf der Festplatte als smp-file (sample-file) gespeichert. Um den
file auf Diskette zu speichern, unter Report File New anklicken, dann den File als rpt- file (reportfile)
unter a: abspeichern. Wenn die alte Sequenz wieder aufgerufen werden soll: Im Programm
Image Analysis, in dem wir uns befinden, über File und Open Sample die gewünschte Datei öffnen.
Dabei auf Dateinnamen der Sample-files achten, da nur ein Dateiname für das Bild/Gel existiert
(z.B. FP02), aber mehrere Dateinamen für mehrere Sequencen auf dem Bild/Gel exisitieren
(z.B. FP02A, FP02B etc.). Soll eine neue Sequenz auf selbem Gel erstellt werden: File und New
Sample anwählen, soll eine neue Sequenz auf anderem Gel erstellt werden: File und Open Image
anwählen. Insbesondere die äußeren Sequenzen zeigen oft keine gradlinige Bandenspur. Per Smile-Correction
unter Enhancement kann per Anklicken von Define und dem manuellen Verschieben

Methodenskript AG Cypionka - 50 -
einzelner Banden zueinander eine gerade Basislinie eines jeden Gelspur-Quartetts erzeugt werden.
Danach muß unbedingt das Band Spacing überprüft werden. Anmerkung: Mit gleichzeitigem einfachen
Klick beider Maustasten im grünen Hintergrund im Eingangsmenü erhält man Gesamtübersicht
über noch geöffnete Programme.
Bezeichnung der Basen und Ambiguities nach IUPAC-Nomenklatur:
IUPAC Bedeutung Komplement
A A T
C C G
G G C
T/U T A
M A, C K
R A, G Y
W A, T W
S C, G S
Y C, T R
K G, T M
V A, C, G B
H A, C, T D
D A, G, T H
B C, G, T V
N G, A, T, C N
Nachbereitungen:
Nach der Elektrophorese muß das alte Gel entsorgt, und die Glasplatten sowie anderes Zubehör
gereinigt werden. Dazu den Laufpuffer aus oberer Elektrophorese-Kammer mit Hilfe eines
Schlauches in einBecherglas laufen lassen und die untere graue Kammer entnehmen. Dabei muß
der Glasstift schonend behandelt werden. Anschließend den Kamm aus dem Gel entfernen, die
obere Pufferkammer abnehmen und die Glasplatte mit dem Gel aus dem Sequencer nehmen. Danach
die untere Pufferklammer entleeren und den Puffer verwerfen. Anschließend werden die seitlichen
Halterungsschienen von den Glasplatten abgeschraubt und die obere Glasplatte abgehoben.
Das Gel wird mit Kleenex von der Glasplatte gehoben und in den normalen Müll gegeben. Alles,
d. h. auch die Pufferkammern, werden mit Wasser und ddWasser gespült (Handschuhe) und zum
Trocknen in den grauen Ständer gestellt. Die Spacer müssen besonders gründlich gespült werden,
da sie fest mit Acrylamid behaftet sind.

Methodenskript AG Cypionka - 51 -
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Die DGGE ist eine molekularbiologische Methode, die verschiedene DNA Sequenzen gleicher
Länge voneinander trennt. Die Trennung erfolgt in einem Polyacrylamidgel, in das ein Gradient
denaturierender Agenzien (Harnstoff und Formamid) eingegossen wird. In diesem denaturierenden
Gel wandern verschiedene DNA Sequenzen auf unterschiedliche Weise (abhängig vom GC-
Gehalt und sich bildenen Schmelzdomänen) und werden dadurch voneinander getrennt. Weitere
theoretische Grundlagen s. Muyzer et al. 1993.
I. Materialien
Der Arbeitsgruppe stehen zwei DGGE-Apparaturen zur Verfügung. Dabei handelt es sich um eine
ältere Apparatur der Firma BioRad und um ein neues Model der Firma Ingeny. Da die wesentlichen
Schritte des Protokolls für beide Apparaturen identisch sind, sind nur Abweichungen für die
einzelnen Geräte mit (alt) für BioRad und (neu) für Ingeny gekennzeichnet.
DGGE-Apparratur von BioRad (alt):
DGGE-Apparatur von Ingeny (neu):
a) Gel
- Harnstoff (Urea)
- Formamid
- 50 x TAE Puffer pH 7,4 (242 g Trisbase, 57,1 ml konz. Essigsäure, 100 ml 0,5 M EDTA pH
7,4, mit doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 0) auf fast 1000 ml auffüllen, titrieren mit konz. Essigsäure
auf pH 7,4, Volumen mit ddH 2 0 auf 1 l auffüllen.
- Acrylamid/Bisacrylamid 40 %ig (37,5:1)
- ddH 2 0
- 10 % Ammoniumpersulfat (APS), frisch/eingefroren
- Tetramethylethylendiamin (TEMED )
- Laufpuffer (alt): 6,6 l 1 x TAE pH 7,4, hergestellt aus 50 x TAE pH 7,4: 132 ml 50 x TAE +
6.468 ml ddH 2 0
- Laufpuffer (neu): 17 l 1 x TAE pH 7,4, hergestellt aus 50 x TAE pH 7,4: 340 ml 50 x TAE +
16.660 ml ddH 2 0
b) Sonstiges
- Ethanol konz.
- 3 x 50 ml Bechergläser
- Kanüle und Schläuche

Methodenskript AG Cypionka - 52 -
- 1 große und 1 kleine Glasplatte
- 2 Spacer (alt); 1 Spacer (neu)
- 4 Halterungen mit Schrauben (alt)
- Schraubenschutz (neu)
- Gießstand
- Kamm mit 20 - 48 Zähnen
- Gradientenmischer
- DGGE-Apparatur
- Magnetrührer
- Rührfisch, Gegenvolumen
- Dreiwegehahn
c) Färbung
- 2 schwarze Wannen
- 500 ml 1 x Sybr Gold Färbelösung (50 µl Sybr Gold (10.000 fach Konzentriert) werden in
500 ml 1 x TAE-Puffer pH 7,4 gelöst)
- 500 ml ddH 2 O
- 50 ml Spritze
- Schüttler
II. Vorbereitung
Sauberes Arbeiten ist erforderlich:
- Eine große und eine kleine Glasplatte, zwei Spacer (alt), ein Spacer (neu) und der Kamm mit
ddH 2 O säubern. Bei den Glasplatten mit Ethanol das ddH 2 O entfernen.
- Glasplatten mit zwei Spacern und zwei Halterungen zusammenschrauben. Nach dem Zusammenbauen
die Bündigkeit der Spacer mit dem unteren Plattenrand überprüfen (alt).
- Glasplatten mit Spacer und Schraubenschutz zusammenlegen (neu)
- Die Glasplatten in den dafür vorgesehenen Ständer einspannen
- Kamm ebenfalls zwischen den Glasplatten stecken
- Schläuche des Gradientenmischers zusammenstecken. Den Rührfisch in die vordere und das
Gegenvolumen in die hintere Kammer geben.
- Magnetrührer anstellen
- 3 Bechergläser bereitstellen. Das APS (Gefrierfach), TEMED und die Stammlösungen (Kühlschrank)
bereit stellen.
-
III. Gießen des Gels
- Lösung A, B und C (s. u.) unter dem Abzug herstellen und in den bereitgestellten Bechergläsern
mischen
- Erst kurz vor dem Gießen wird APS und dann TEMED dazugeben (erst nur die Lösungen B
und C mit den Chemikalien versetzen)
- Lösung C in die vordere Kammer des Gradientenmischers geben (höhere Konzentration!).
Dreiwegehahn am Gradientenmischer muß geöffnet sein, aber die Kanüle darf noch nicht auf
dem Schlauch stecken (zu hoher Wiederstand).
- Hahn des Gradientenmischers kurz öffnen, damit die Luftblase entweichen kann

Methodenskript AG Cypionka - 53 -
- Lösung B in die hintere Kammer des Gradientenmischers geben (niedrigere Konzentration!),
dabei den Hahn des Gradientenmischers geschlossen halten
- Gradientenmischer auf den Magnetrührer stellen, dabei den Schlauch so hoch halten wie möglich
(mindestens über den Gradientenmischer, Dreiwegehahn des Schlauches ist offen!)
- Die Kanüle auf den Schlauch stecken und die beiden Kammern durch Umlegen des Hahns
verbinden
- Die Kanüle zwischen die Glasplatten stecken und das Gel zwischen die Glasplatten laufen
lassen. Dabei sollte eine Vermischung der Lösungen in der vorderen Kammer des Gradientenmischers
zu beobachten sein
- Die komplette Flüssigkeit, auch aus dem Schlauch auslaufen lassen. Dabei ist darauf zu achten,
daß die Kanüle während des Gießens nicht ins Gel eintaucht. Zudem darf die Lösung des
Gradienten den Kamm nicht erreichen. Vorher die Kanüle entfernen und restliche Lösung in
einen Becher laufen lassen.
- Lösung A mit APS und TEMED versetzen
- Mit einer 10 ml Spritze Lösung A aufnehmen und die Kanüle auf die Spritze stecken
- Lösung A vorsichtig an einer Seite aufs Gel geben. Der Gradient darf dabei den Kamm nicht
berühren, deshalb die Seiten häufiger wechseln.
- Das Gel bis an den Rand gießen, so dass es fast überläuft
- Mindestens 2 - 4 h warten, bis das Gel auspolymerisiert ist
- Sämtliche Becher, Schläuche und Geräte gut mit ddH 2 O ab- und durchspülen
Vorschrift zur Herstellung der Stammlösungen 0 % und 80 %:
Substanz Stammlösung 0 % denaturierend Stammlösung 80 % denaturierend
Harnstoff (Urea) - 50,4 g
Formamid - 48 ml
50 x TAE, pH 7,4 3,0 ml 3,0 ml
Acrylamid/Bisacrylamid 22,5 ml 22,5 ml
Auffüllen mit ddH20 auf 150 ml 150 ml

Methodenskript AG Cypionka - 54 -
Vorschrift zur Herstellung der Lösungen A, B und C: als Beispiel ein Gradient von 40 – 70 %
Substanz Lösung A (Sammelgel)
Lösung B
(40 %)
Lösung C
(70 %)
alt neu alt neu alt neu
Stammlösung 0 % 5 ml 9 ml 5,75 ml 12 ml 1,4 ml 3 ml
Stammlösung 80 % - - 5,75 ml 12 ml 10,1 ml 21 ml
Endvolumen 5 ml 9 ml 11,5 ml 24 ml 11,5 ml 24 ml
Zugabe vor dem Gebrauch
TEMED 5 µl 8 µl 8 µl 17 µl 8 µl 17 µl
APS (10 %) 25 µl 100 µl 41 µl 86 µl 41 µl 86 µl
Bei einem anderen Gradienten müssen die Stammlösungen in einem anderen Verhältnis gemischt
werden. Dabei sollten die Lösungen B und C immer ein Endvolumen von 11,5 ml (alt) oder 24 ml
(neu) besitzen. Die Mengenangaben für TEMED und APS verändern sich bei einem anderen Gradienten
nicht.
IV. Beladung des Gels und Elektrophorese
- Laufpuffer (1 x TAE, pH 7,4) direkt im Elektrophoresebehälter aus der Stammlösung (50 x
TAE) herstellen. Wasser (ddH 2 O) bis zur Pfeilspitze am Behälter auffüllen. Der Puffer reicht
für ca. 3 Läufe (alt).
- 17 l Laufpuffer direkt im Elektrophoresebehälter aus der Stammlösung (50 x TAE) herstellen.
Nach dem Ansetzen der Gesamtmenge, müssen für weitere Läufe nur 5 l Laufpuffer ausgetauscht
werden. Dafür werden 5 l alter Puffer entfernt und aus der Stammlösung (50 x TAE)
5 l neuer Puffer hergestellt und damit die Laufkammer wieder aufgefüllt (neu).
- Deckel aufsetzen
- Mindestens 2 h vor dem beladen des Gels den Puffer auf 65 °C (alt) oder 60 °C (neu) erhitzen
- Während der Puffer aufgeheizt wird, werden die PCR-Proben für das Beladen auf das Gel
vorbereitet, eventuell eine Aufreinigung durchführen (s. Aufreinigung von PCR- Produkten):
Endvolumen max. 40 µl, Proben 1:3 mit einem 6 x Loading-Puffer (für die Zusammensetzung
s. Agarosegel-Elektrophorese) mischen.
- Das Gel in die Halterung der DGGE-Apparatur einklicken (alt). Die gesamte Gießvorrichtung
samt Gel in die Elektrophoresekammer stellen (neu). Vorher den Kamm vorsichtig entfernen.
Auf der anderen Seite zwei leere Glasplatten als Dummy benutzen. Die Halterung in den Behälter
hängen (alt).
- Anschlüsse für die Elektrophorese und Pumpe mit dem Gießstand verbinden und die Stromzufuhr
auf Low Voltage (LV) stellen (neu)
- Pumpe anstellen (alt)
- Soll-Wert-Temperatur auf 60 °C stellen (alt)
- Vor der Auftragung der Proben das Gerät noch einmal ausstellen und den Deckel abnehmen
(alt)
- Die einzelnen Taschen müssen vor einer Auftragung der Proben gespült werden. Dafür mit
einer 2 ml Spritze mit Kanüle Pufferlösung aus der Kammer aufziehen und sämtliche Taschen
vorsichtig spülen. Diesen Vorgang insgesamt zwei Mal durchführen (alt).
- Mit max. 40 µl Probe pro Tasche das Gel beladen. Dafür spezielle Spitzen mit ausgezogener
Spitze verwenden.
- Deckel wieder auf die Kammer stellen und das Gerät einschalten (alt)

Methodenskript AG Cypionka - 55 -
- Am Power-Pack eine Spannung von 50 V einstellen. Nach 30 min die Spannung auf 100 V
erhöhen (alt). Stromzufuhr auf High Voltage (HV) umstellen und die Spannung auf 100 V
einstellen (neu). Die Laufzeit des Gels beträgt zwischen 18 h und 22 h.
V. Auswertung der Elektrophorese
- DGGE-Apparatur und Spannungsquelle ausstellen
- Gel aus der Halterung entnehmen und Schrauben lösen
- Obere Glasplatte vorsichtig abheben
- Stege der Geltaschen mit einem Spacer vorsichtig abtrennen und bei einer symetrischen Probenauftragung
eine Ecke des Gels entfernen, um die Auftragungsrichtung später rekonstruieren
zu können
- Gel mit der unteren Glasplatte über der Färbelösung in die Glasschale (in einer schwarzen
Wanne) halten und vorsichtig das Gel von der Platten lösen lassen, so dass das Gel sich in der
Färbelösung befindet
- Zur Färbung der DNA im Gel 1 x Sybr Gold als Färbelösung verwenden
- Glasschale mit der zweiten schwarzen Wanne abdecken (Färbelösungen sind Lichtempfindlich)
- 1 - 2 h leicht schütteln
- Färbelösung mit einer 50 ml Spritze vollständig entfernen (die Färbelösung kann wiederverwendet
werden)
- Das Gel mit 500 ml ddH 2 O mindestens 20 min wässern
- Das Gel mit einer Bildanalyse dokumentieren und speichern
Während der Färbung unbedingt Handschuhe und Kittel tragen!
VI. Reinigung und Entsorgung
- Kamm, Spacer und der Gießstand werden sorgfältig mit VE-Wasser und ddH 2 O gereinigt
- Die Glasplatten werden mit min. 10 %igen SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) gründlich von
sämtlichen Acrylamidresten gereinigt (Acrylamid ist nicht Alkohol- und Wasserlöslich). Anschließend
wird das SDS auf den Glasplatten mit VE-Wasser gründlich entfernt (SDS würde
eine erneute Polymerisation des Acrylamids verhindern). Um Wasserflecken und Salzreste zu
entfernen, werden die Glasplatten anschießend mit Ethanol abgespühlt und getrocknet.
- Das Gel sowie verwendete Handschuhe und Tücher im Sonderabfall entsorgen
- Die Färbelösung und verwendetes ddH 2 O, welches mit dem Farbstoff in Berührung kam, im
Färbeabfall entsorgen

Methodenskript AG Cypionka - 56 -
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) mit rRNA-Oligonukleotid-Sonden
zum spezifischen Nachweis verschiedener phylogenetischer
Gruppen
Einleitung
Die Technik der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) mit rRNA-Oligonukleotid-Sonden
wurde Ende der 80er-Jahre zum ersten Mal beschrieben (Giovannoni et al., 1988; DeLong et al.,
1998; Amann et al., 1990) und wird seitdem als ein „Durchbruch“ in der mikrobiellen Ökologie
gefeiert. Sie bietet die Möglichkeit einer Charakterisierung von Prokaryoten (Bakterien und Archaeen)
auf verschiedenen phylogenetischen Ebenen ohne vorherige Kultivierung. Es handelt sich
bei dieser Methode um eine Färbetechnik an fixierten Zellen mit anschließender mikroskopischer
Auswertung. Die Selektivität der Färbung beruht auf der besonderen Organisation der ribosomalen
RNA. Durch eine vergleichende Sequenzanalyse können meist auf der kleinen Untereinheit der
ribosomalen RNA (16S bzw. 18S rRNA) Bereiche ermittelt werden, die auf unterschiedlichen
phylogenetischen Ebenen (Gattung bis Domäne) einheitlich sind. Diese, etwa 18 Basenpaare langen
Genabschnitte dienen als Zielsequenz für Oligonukleotide, die mit einem Fluoreszenz-
Farbstoff (z.B. Cy3) markiert sind. Im Verlauf verschiedener Arbeitsschritte werden zunächst die
Zellen von Reinkulturen oder bakteriellen Gemeinschaften aus Umweltproben auf einem Objekträger
fixiert. Danach werden sie mit der Oligonukleotid-Sonde in Kontakt gebracht, die in die
Zellen gelangt und an der Zielsequenz auf der ribosomalen RNA bindet (hybridisiert). Die spezifischen
Bedingungen hierfür müssen jede Sonde ausgetestet werden. Nach der eigentlichen Hybridisierung
werden unspezifisch gebundene Sonden abgewaschen und die Zellen mit einem herkömmlichen
Farbstoff (z.B. DAPI) gegengefärbt. Die fertigen Präparate werden mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie
analysiert. Die Wahl verschiedener Filter erlaubt die Unterscheidung von
unspezifisch- (DAPI) und spezifisch (FISH) gefärbten Zellen. Probleme liegen insbesondere im
Design und Testen neuer Sonden, sowie in der Analyse von natürlichen Gemeinschaften. Zellen
aus natürlichen Standorten liegen oft in einem physiologischen Zustand vor, in dem sie eher eine
geringe Zahl an Ribosomen aufweisen und zeigen daher eine geringere Fluoreszenz. Ein weiteres
Problem können störende Komponenten des Standortes darstellen (z.B. Sediment oder Ausfällungen),
die ebenfalls eine Fluoreszenz besitzen oder die Hybridisierung behindern. Weitere Aspekte
zur Anwendung der Methode in der mikrobiellen Ökologie können im Review von Ammann &
Ludwig, 2000 nachgelesen werden.
Material:
Geräte:
Objekträger, Epoxy-beschichtet, mit acht Kammern, ∅ 6mm
Hybridisierungskammern (Greiner Röhrchen oder Falcon Tubes)
Hybridisierungsofen
Wasserbad
Blockthermostat
3 Färbekammern
Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtersatz für DAPI und Cy3
Greiner Röhrchen oder Falcon Tubes zum Waschen
Chemikalien und Reagenzien:
Oligonukleotid-Probes, Cy3 markiert
Fixierte Zellen von Bakterien-Reinkulturen zum Testen der Spezifität der Probes

Methodenskript AG Cypionka - 57 -
Stammlösungen:
NaCl-Stammlösung (5 M), autoklaviert:
1000 ml = 292,2 g NaCl
100 ml = 29,22 g NaCl
Tris/HCl-Stammlösung (1 M, pH 7,2), autoklaviert:
1000 ml = 157,6 g Tris/HCl
500 ml = 78,8 g Tris/HCl
250 ml = 39,4 g Tris/HCl
100 ml = 15,76 g Tris/HCl
SDS-Stammlösung (1%), sterilfiltriert:
100 ml = 1g SDS
DAPI-Lösung (1 µg/ml):
10 ml = 10 µg DAPI
DABCO-Lösung
25 mg 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octan in
1 ml PBS-Puffer +
9 ml Glycerin
Arbeitslösungen:
Hybridisierungspuffer mit 35% Formamid:
Formamid 17,5 ml 3,5 ml 350 µl 175 µl
NaCl (5 M) 9 ml 1,8 ml 180 µl 90 µl
Tris/HCL (1 M) 1 ml 0,2 ml 20 µl 10 µl
SDS (1%) 0,5 ml 0,1 ml 1 0 µl 5 µl
H 2 O bidest. 22 ml 4,4 ml 440 µl 220 µl
Waschpuffer mit 35% Formamid (80 mM NaCl):
NaCl (5 M) 16 ml 8 ml
Tris/HCL (1 M) 20 ml 10 ml
SDS (1%) 10 ml 5 ml
H 2 O bidest. ad. 1000 ml ad. 500 ml

Methodenskript AG Cypionka - 58 -
Konzentration von NaCl im Waschpuffer bei verschiedenen Konzentrationen von Formamid
im Hybridisierungspuffer:
Formamid im
Hybridisierungspuffer [%]
NaCl im
Waschpuffer [mM]
0 900
5 636
10 450
15 318
20 225
25 159
30 112
35 80
40 56
45 40
50 28
55 20
60 14
65 10
70 7
75 5
80 3,5
Durchführung:
Objekträger vorbereiten:
Die Vertiefungen der Objekträger (acht Kammern, ∅ 6mm) mit Beschichtungslösung benetzen
und die so behandelten Objekträger an der Luft trocknen lassen (längere Lagerung möglich).
Auftragen der Proben:
Zell- oder Sedimentsuspension (3-4 µl) in die Vertiefungen der beschichteten Objekträger geben
und an der Luft trocknen lassen (15 min). Bei Standortproben bis zu 10 µl möglich, evtl. eintrocknen
lassen (auf Thermoblock, 50-60°C) und erneut mit Probe versehen.
Lysozymbehandlung (nur bei Gram-positiven Bakterien):
Nach dem Antrocknen der Bakteriensuspension werden 10 µl einer Lysozymlösung (10 mg pro
ml PBS-Puffer = 1% Lysozym) getropft und bei Raumtemperatur mit einer Schale als Staubschutz
abgedeckt inkubieren (15 min). Danach Lysozymlösung mit ddH 2 0 (Spritzflasche) abspülen.
Hybridisierungskammer (Falcon Tube) vorbereiten:
Zellstoff falten, in das Röhrchen legen und mit Hybridisierungspuffer (1,5 ml) beträufeln. Anschließend
das Röhrchen zur Einstellung eines konstanten Dampfdruckes in den Hybridisierungsofen
legen (30 min) und inkubieren (46°C).
Ethanolbehandlung in Färbekammer:
Die Objekträger in das erste Ethanolbad legen (50%, 3 min), danach
die Objekträger in das zweite Ethanolbad legen (80%, 3 min), anschließend die Objekträger in
das dritte Ethanolbad legen (96-98%, 3 min) und die Präparate an der Luft trocknen lassen. Die
Ethanolbäder können mehrfach verwendet werden.
Hybridisierung der Proben:

Methodenskript AG Cypionka - 59 -
Je Ansatz werden 7 µl Hybridisierungspuffer (frisch ansetzen!) und 1 µl Sonde (50 ng/µl) benötigt.
Mastermix für die entsprechende Probenmenge herstellen und vorheizen (46°C). Danach die
Hybridisierungslösung (je 8 µl) in die Vertiefungen pipettieren. Die Objekträger vorsichtig in die
vorbereiteten Hybridisierungskammern legen und inkubieren (46°C, 2 h).
Stoppen der Reaktion:
Je zwei Objekträger Rücken an Rücken in ein Falcon Tube geben und in kaltem ddH 2 0 schwenken.
Anschließend das Wasser verwerfen.
Entfernen unspezifisch gebundener Sonden:
Je zwei Objekträger Rücken an Rücken in ein Falcon Tube geben und in vorgewärmten Waschpuffer
schwenken (48°C, 20 min). Anschließend den Waschpuffer verwerfen, die Objekträger
erneut mit ddH 2 0 abspülen (Spritzflasche benutzen) und die Präparate an der Luft trocknen lassen.
Einbetten und Gegenfärbung:
In die Vertiefungen wird je ein Tropfen (1 µl) eines 1:1-Gemisches bestehend aus DAPI- und
DABCO-Lösung (= Einbettungsmedium) pipettiert. Der Objekträger wird mit einem Deckgläschen
abgedeckt und nach Einwirken der Färbelösung (ca. 5 min) mikroskopiert oder dunkel gelagert.

Methodenskript AG Cypionka - 60 -
Quantitative PCR
Einleitung
Die quantitative PCR, auch Real-Time-PCR genannt, ist eine Methode, die es ermöglicht die
Amplifizierung eines spezifischen Sequenzabschnittes (target) während des Experiments über
Fluoreszenzmessungen zu verfolgen. Zu welchem Zeitpunkt während der cyclischen Amplifizierung
die Konzentration der PCR-Produkte messbar wird, hängt ab von der Zahl an Zielsequenzen
(targets) in der eingesetzten DNA (template). Dies bildet die Grundlage für die Quantifizierung
von spezifischen Zielsequenzen und somit der Zahl an Organismen in der Ausgangsprobe (z.B.
Umweltprobe). Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten der Durchführung:
• Einsatz von spezifischen Primern in Kombination mit interkalierenden Substanzen (z.B.
SYBRGreen I), die nach Einlagerung in doppelsträngige DNA fluoreszieren.
• Einsatz von fluoreszenzgelabelten spezifischen Sonden (FRET- und TaqMan-Sonden, Molecular
Beacons etc.).
In diesem Skript soll die erste Methode beschrieben werden.
Durchführung
Grundsätzlich gelten für die Real-Time-PCR die selben allgemeinen Arbeitsanleitungen wie für die
PCR. Es gibt jedoch einige Abwandlungen. So werden in der Real-Time-PCR nur „halbe“ Ansätze
(25µl) gefahren. Es werden 10µl stärker verdünnter DNA-Lösungen eingesetzt. Dies verringert
den Pipettierfehler und verbessert die Quantifizierung. Bei der Real-Time-PCR wird eine farbstofffreie
DNA-Polymerase eingesetzt (New England Biolab Taq DNA-Polymerase, 5U/µl). Dadurch
kann eine störungsfreie Fluoreszenzmessung garantiert werden. Der 10fach konzentrierte
PCR-Puffer für die NEB Taq Polymerase enthält: 10mM KCl, 10mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 20mM Tris-
HCl, 2mM MgSO 4 , 0,1% Triton X-100 (pH=8,8). Als Fluoreszenzmittel soll SYBRGreen I TM
genutzt werden. Pro Ansatz wird 1µl einer 400fachen Verdünnung der SYBRGreen I-
Stammlösung eingesetzt. Da SYBRGreen I, wie alle interkalierenden Substanzen mutagen ist,
müssen bei der Herstellung der Verdünnung grüne Gifthandschuhe getragen werden.
Lösung
Volumen [µl]
10 x Puffer(2mM MgCl2) 2,5
dNTPs ( 2,5mM each) 2
BSA(20mg/ml) 0,25
MgCl2 (10mM) 0,75
PCR H 2 O dest. 7,4
357f (10pmol/µl) 0,5
907R (10pmol/µl) 0,5
SYBRGreen I (1:400) 1
NEB Taq-Polymerase (5U/µl) 0,1
DNA-Template 10
Endvolumen 25
Temp. [°C] Time [min] Cycles
96 4 1
94 1
55 1 40
72 2 Fl.-Messung
72 10 1
25 1 1
Die Fluoreszenz wird in jedem
Zyklus nach der Elongation
gemessen
Beispiel für einen PCR-Ansatz und das dazugehörige Temperaturprogramm

Methodenskript AG Cypionka - 61 -
Der Thermocycler
Durchgeführt wird die Real-Time-PCR am Thermocycler „ROTOR-GENE 2000/3000“ der Firma
„Corbett-Research“. Der Cycler wird durch einen angeschlossenen Computer über die ROTOR-
GENE Software gesteuert. Es existiert ein Handbuch in dem alle Details ausführlich dargestellt
sind. Hier sollen nur die wichtigsten Punkte aufgeführt werden. Der Cycler verfügt über ein
36/72er Dual-Kanal-Rotorsystem, wobei für unsere Zwecke der 36er Rotor (s.Abb), der mit 36
Flachdeckel PCR-Tubes (0,2ml) beladen werden kann, ausreicht. Der Rotor muß immer voll bestückt
sein, leere Positionen werden mit leeren Tubes aufgefüllt. Der ROTOR-GENE-Cycler ist
mit 2 Detektions-Einheiten ausgestattet. Kanal (1) detektiert bei 510nm und Kanal (2) detektiert
bei 555nm. Dies ermöglicht Multiplex-Detektionen mit 2 Farbstoffen gleichzeitig.
Sobald das Probenröhrchen die Detektions-Einheit passiert, wird es durch hochenergetische
Blitze der entsprechenden Wellenlänge angeregt, und das entstehende Emissionslicht durch einen
Photomultiplier gemessen. Diese Daten werden an den PC gesandt und dort graphisch dargestellt
(Fluoreszenzeinheiten / Cyklusnummer, s.Abb.).
Die ROTOR-GENE Software
Vor dem Start der ROTOR-GENE Software muß der Cycler eingeschaltet werden, da die Software
sonst nur im virtuellen Modus läuft.
Nach dem Start des ROTOR-GENE Programms erscheint zuerst das Experiment-Menüfenster
Die Option NEW öffnet das Auswahlfenster, um ein
neues Experiment vorzubereiten und zu starten.
Vor dem Start der PCR: Die Toolbar-Arbeitsoberfläche
EXP. INFO (SETTINGS)
Hier wird der Name des Operators und des Experiments eingegeben, außerdem werden das Reaktionsvolumen,
der Detektionskanal für die Fluoreszenzmessung und der Rotor des Cyclers ausgewählt.

Methodenskript AG Cypionka - 62 -
PROFILE
Hier wird das Temperaturprogramm für die PCR geschrieben, dabei können die Optionen HOLD,
CYCLING und MELT ausgewählt werden.
HOLD: Auswahl einer Temperatur, die über einen bestimmten Zeitraum gehalten wird
(DENATURE: Extraoption für den ersten Deaturierungsvorgang)
CYCLING: Auswahl von max. 5 nacheinander ablaufenden Temperaturen und Zeiträumen (Deaturierung,
Annealing, Elongation, siehe PCR-Methodenteil). Unter dieser Option wird auch der
Zeitpunkt der Fluoreszenzmessung bestimmt. Da durch interkalierende Substanzen nur doppelsträngige
DNA detektiert werden kann, erfolgt die Fluoreszenzmessung direkt nach der Elongation
(bei 72°C). An dieser Stelle muß beachtet werden, dass durch den Einsatz interkalierender
Substanzen auch unspezifische Produkte (z.B. Primerdimere) detektiert werden. Durch Auswahl
einer Temperatur bei der z.B. Primerdimere wieder aufgeschmolzen sind (über 80°C) kann die
Detektion von unspezifischen Produkten von vorneherein ausgeschlossen werden. Außerdem
können hier auch die Darstellungen für die Rohdaten (Normal/High Sensitive/Low Sensitive) ausgewählt
werden (man lässt sich meistens alle 3 anzeigen).
MELT: Im Anschluss an das PCR-Programm oder separat kann eine Schmelzkurve der PCR Produkte
aufgenommen werden. Dabei wird die Temperatur langsam von einer niedrigen Ausgangstemperatur
(meist 50°C) über 1°C-Schritte auf 99°C erhöht. Dabei wird kontinuierlich die Fluoreszenz
für alle Proben gemessen. Vor dem Lauf muß die Anfangstemperatur der Schmelzkurve
über einen Zeitraum von mind. 1 min konstant gehalten werden.
HOLD
DENATURE
bzw.
MELT
CYCLING

Methodenskript AG Cypionka - 63 -
SAMPLES
Hier werden die Namen des Proben eingetragen. Man kann zwischen SAMPLE, NTC (non template
controle), STANDARD und NONE wählen. Für die Standards können auch Konzentrationen
bzw. Kopienzahlen angegeben werden.
START
Beim Starten des PCR-Laufs erscheint nochmals das PCR-Profil. Außerdem wird das Experiment
gespeichert. Die Rohdaten der Fluoreszenzmessungen und der Temperaturverlauf
können während des gesamten PCR-Laufs auf dem Bildschirm verfolgt werden.
Nach Beendigung der PCR: Das Analysemenü
Durch Klicken auf den ANALYSIS-Button im Toolbarmenü wird das Analysenmenü geöffnet.
Das „Analysis“-Fenster ermöglicht es neue Analysen durchzuführen
bzw. zeigt bereits durchgeführte an. Als Analysen stehen:
COMP. QUANTITATION, ALLELIC DISC., MELT und
QUANTITATION zur Verfügung, wobei nur die beiden letzteren
für uns interessant sind. Bei Auswahl einer der Analysen erscheint
die Liste der möglichen Kanäle in den die Auswertungen durchgeführt
werden können. Um die Analyse sichtbar zu machen, genügt
ein einfacher Doppelklick auf dem Kanal-Namen.
QUANTITATION
Bei Doppelklick auf diese Analysenfunktion werden drei Fenster geöffnet, das Hauptfenster in
dem die normalisierten Kurven der Rohdaten zu sehen sind, das Standardkurvenfenster (wenn
Standards bei der PCR definiert wurden) und das Ergebnisfenster, in dem sämtliche Daten der
einzelnen Proben aufgelistet sind.
Hauptfenster
Die normalisierten Rohdaten werden hier linear bzw. logarithmisch dargestellt (Button: LINEAR
SCALE/LOG. SCALE)
CT-CALCULATION
Der Ct-Wert (cycle time-Wert) ist der Punkt, an dem der Schwellenwert (Threshold) die Amplifikationskurven
schneidet. Er gibt den Startzeitpunkt der exponentiellen Amplifikation an. Er kann

Methodenskript AG Cypionka - 64 -
direkt in Bezug zur Ausgangskopienzahl gesetzt werden. Der Threshold kann automatisch über
den AUTO-FIND THRESHOLD-Button (nach Eingabe von Minimum und Maximum) oder manuell
über den Button rechts neben dem THRESHOLD eingestellt werden. Über den Button
rechts neben ELIMINATE CYCLES BEFORE können die ersten PCR-Zyklen, die meist höhere
Schwankungen in der Hintergrundfluoreszenz aufweisen, aus den Berechnungen eliminiert werden.
Standardkurve
In der Standardkurve sind die Ct-Werte gegen die für die Standards ausgewählten Einheiten
(Konzentration, Kopienzahl etc.) aufgetragen. Die Standardkurve kann durch hinzufügen bzw.
entfernen von Standards verändert werden. Die blauen Punkte in der Kurve zeigen die als Standard
definierten Proben an, die roten die Werte der unbekannten Proben.
R-value: Korrelations-Koeffizient, Zahl zwischen 1
und –1, die angibt wie gut eine Kurve die Beziehung
zwischen 2 Variablen (in diesem Fall: y =
mx+b) ausdrückt. Ein guter Wert liegt bei 0,99
bzw. –0,99.
CONC=.... : gibt das Verhältnis zwischen Ct-Wert und target-Konzentration im Template an.
TYPE FLOATING: Bei Auswahl dieser Option wird die Standardkurve bei Veränderung des
Thresholds neu berechnet.
TYPE FIXED: Bei Auswahl dieser Option bleibt die Standardkurve auch bei Veränderung des
Threshold unverändert. Dies ist sinnvoll, wenn die Standardkurve auch für andere Experimente
genutzt werden soll.
IMPORT CURVE: hier kann eine Standardkurve aus einem anderen Experiment importiert und
zur Berechnung herangezogen werden.
Ergebnisfenster

Methodenskript AG Cypionka - 65 -
Neben den Ct-Werten (Ct) und deren Standardabweichung (CT STD. DEV.), sind auch die als
Standard definierten Konzentrationen (GIVEN CONZ.) und die aus den Ct-Werten berechneten
Konzentrationen (CALC. CONC.= m*Ct + b) angegeben, die optimalerweise identisch sein sollten.
Der CV-Wert (Koeffizient der Variation = 1-[berechnete Konzentration zu gegebene Konzentration])
wäre in diesem Fall 0. Das Ergebnisfenster kann über die rechte Maustaste nach
Excel exportiert werden.
MELT
Die Schmelzkurve stellt das Schmelzverhalten der PCR-Produkte nach dem Lauf dar. Sie ermöglicht
es spezifische Produkte von unspezifischen (z.B. Primerdimere) zu unterscheiden.
Amplifikationsprodukte
Primerdimeree
Agarosegelelektrophorese
Nach dem PCR-Lauf werden 5µl der PCR-Produkte (Zugabe von 3µl loading buffer nötig, da die
NEB Taq Polymerase keinen Farbstoff und kein Glycerin enthält) zusätzlich auf einem 1,5%igen
Agarosegel aufgetrennt (s. d.).

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