Methodenskript

Methodenskript AG Cypionka - 45 -
DNA-Sequenzierung nach Sanger (Kettenabbruch-Methode) am
LiCor DNA Sequencing System 4200 von MWG Biotech
Einleitung
Eine Sequenzierreaktion nach Sanger ist im Prinzip eine PCR mit nur einem Primer. Da hier
ebenfalls mit verschiedenen Temperaturzyklen gearbeitet wird spricht man auch von (engl.) „Cycle
Sequencing“. Die Entschlüsselung einer einzelnen Sequenz erfordert die Verwendung von vier
verschiedenen Ansätzen, bei denen jeder ein anderes Didesoxynukleotid (ddNTP) als „Abbruchnukleotid“
enthält. Die Didesoxynukleotide sind zu 3% der „normalen“ dNTPs im Reaktionsansatz
enthalten. Es gibt also je einen Ansatz mit einem Anteil an ddATP, ddGTP, ddCTP,
oder ddTTP. Die ddNTPs werden von der DNA-Polymerase wie die normalen dNTPs eingebaut,
führen jedoch, da ihnen die OH-Gruppe am 3´-Ende fehlt, zu einem Kettenabbruch. Nach einer
statischen Verteilung des Einbaus der ddNTPs, erhält man somit in jeder Reaktion ein Gemisch
verschieden langer DNA-Fragmente, die alle auf ein bestimmtes Nukleotid enden (im Ansatz mit
ddATP also auf A).
Die vier Ansätze werden nebeneinander auf ein Gel aufgetragen und das Gemisch der DNA-
Fragmente elektrophoretisch ihrer Größe nach getrennt (kurze Fragmente laufen schneller als lange
Fragmente). Die Verwendung eines fluoreszierenden Primers ermöglicht die computergesteuerte
Detektion der DNA-Banden über einen Laser, der ähnlich wie ein Scanner über das Gel läuft.
Die an ihm vorbeilaufenden Banden werden zur Fluoreszenz angeregt und können somit detektiert
werden. Das Ergebnis wird an einen Computer weitergeleitet und in ein Bild des Gels übersetzt.
Ein Vergleich der Lauflängen der Banden aus den vier Ansätzen führt zur Aufdeckung der unbekannten
Sequenz. Der schematische Ablauf einer Sequenzierungsreaktion ist in der nachfolgenden
Abbildung dargestellt.
Die Sequenz kann über das Internet an eine Datenbank (Bsp. EMBL, RDP) übermittelt werden,
wo ein Vergleich mit dort abgelegten Sequenzen erfolgt. Als Ergebnis erhält man die prozentuale
Ähnlichkeit zu bekannten Sequenzen.
Material
Geräte:
Thermocycler
LiCor DNA Sequencing System 4200 (incl. Zubehör)
Chemikalien und Reagenzien:
DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit (Amersham)
Sequenzierprimer (IRD-markiert)
Stammlösungen:
TBE-Puffer (10 ×)
Tris Base (890 mM) 108 g
Boric Acid (890 mM) 55 g
Na 2 EDTA × 2H 2 0 (20mM) 7,44 g
H 2 0 (dest.) ad. 1 l