PDF Download - Laborwelt

BR L EI T P Z L O I CR H T
Abb. 4: Charakterisierung eines rekombinanten Proteins.
(1) Das gemessene Intakt-Molekulargewicht (hier: FTMS-Spektrum)
stimmt nicht mit der erwarteten Masse überein!
(2) Die Peptide Map zeigt jedoch weite Bereiche mit korrekter Struktur
des erwarteten Protein A (rot markiert: im Digest gefundene Sequenzabschnitte).
(3) Im MALDI-ISD-Spektrum (Reflektormodus) zeigt sich: Tatsächlich
liegt ein Fusionsprotein aus β-Glucuronidase und Protein A vor, das
N-terminal methyliert ist. Die Berücksichtigung derartiger Informationen
führte zu einer Struktur von rekombinantem Protein A, die das
gemessene Molekulargewicht bestätigt.
1. Stufe: MALDI-TOF Peptide Mapping
Beim tryptischen Verdau eines Proteins entstehen Spaltpeptide,
die in einem Massenbereich von 800 bis 4.000 Da zur Identifizierung
herangezogen werden – die sogenannte Peptide Map. Zum
Vergleich werden die Proteinsequenzen der Datenbank im Computer
sozusagen virtuell „verdaut“: die Massen der tryptischen
Peptide werden berechnet. Als Ergebnis des Vergleichs entsteht
eine Vorschlagsliste der möglicherweise gefundenen Proteine mit
Bewertungszahlen (Score).
Folgende vollautomatisch erfolgende Interpretationen der Suchergebnisse
sind dabei möglich:
+ Das Protein ist eindeutig identifiziert; die Sequenzabdeckung
ist befriedigend.
(+) Ein Protein wurde mit gewisser Signifikanz identifiziert, z.B.
aber als Protein einer anderen Spezies. Für die Spezies der
Suche ist das Protein noch nicht bekannt. Ein sehr wertvolles
Ergebnis, das etwa Informationen zur künftigen Klonierung
liefern könnte. Oder aber es bleiben nicht direkt erklärbare
|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 15