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B L I T Z L I C H T
Einmal bestückt, ist der Sensor-Chip mehrfach,
im Idealfall bis mehr als tausend Mal,
einsetzbar. Man injiziert einen Rohextrakt
oder einen gereinigten Interaktionspartner,
verfolgt die Bindung am Bildschirm
und regeneriert dann die Oberfläche, um
sie im folgenden Zyklus erneut einzusetzen
(Abb. 2). Pro Chip stehen aktuell bis zu
vier separate Meßspuren zur Verfügung,
die getrennt oder gemeinsam angesteuert
werden können. Üblicherweise dient eine
Spur als Kontrolle. Die serielle Injektion
einer einzigen Probe über Meß- und Kontroll-Oberfläche
liefert die in-line-Referenz,
die erheblich zur Präzision der Analysen
beiträgt 4 .
Affinität, Kinetik, spezifische
Konzentration
Nach der Analyse des Proteoms und der
Identifizierung relevanter Proteine ergeben
sich automatisch weitere Fragen.
Sind die Proteine mit Informationen aus
Datenbank und Literatur hinreichend
beschrieben
Agieren die identifizierten Proteine gemeinsam
Existieren weitere Moleküle, mit denen
die Proteine in Wechselwirkung treten
Was ist die Funktion von bislang unbekannten
Proteinen
All diese Fragen führen letztlich zu Bindungsstudien
(Abb. 3). Sowohl der Aufbau
von Molekülkomplexen oder Zellstrukturen
als auch die Aktionen von Rezeptoren
und Regulatoren beruhen auf Wechselwirkungen.
Je genauer man diese kennt, desto
präziser kann man Abläufe während eines
spezifischen biologischen Ereignisses bepartner
bei definierten Konzentrationen
und Pufferbedingungen injiziert. Die Auswerte-Software
greift direkt auf die originalen
Bindungskurven zurück, um Assoziations-
und Dissoziationsraten sowie Affinitäten
zu berechnen. „Globales Fitting“
ist hier das Stichwort, das die simultane
Auswertung eines kompletten Kurvensatzes
bezeichnet. So lassen sich neben Einszu-Eins-Interaktionen
auch komplexere Ereignisse
wie heterogene Proben, Konformationsänderungen
oder Bivalenzen handhaben
6 .
Bei der Bestimmung von Konzentrationen
wird ausschließlich biologisch aktives Material
gemessen. Das am Sensor-Chip gekoppelte
Detektionsmolekül gibt dabei die
Spezifität vor. Für die Nahrungsmittelanalyse
gibt es etwa Kits zur Bestimmung von
Biotin, Folsäure, Vitamin B 12
, Clenbuterol,
Sulfamethazin und Sulfadiazin. Daneben
In naher Zukunft wird die Parallelisierung
dieser Biosensoren weiter erhöht werden:
Eine Kooperation von Millenium Pharmawird
in Kürze ein validiertes System für
die Prozeß-Optimierung und Qualitätskontrolle
auf den Markt kommen 2 .
Interaktionsanalysen
in den Proteomics
Abb. 2: Sensorgramm. Der
Kurvenverlauf zeigt den
Signalanstieg während der
Injektion (Assoziation) und
den Abfall im direkt
anschließenden Pufferfluß
(Dissoziation). Die Kästchen
zeigen den jeweiligen
Zustand am Sensor-Chip.
schreiben und relevante Targets erkennen.
So geben beispielsweise Affinitäten innerhalb
einer Signaltransduktionskette Auskunft
darüber, ob Bindungspartner schon
bei niedrigen Konzentrationen (hohe Affinität)
oder erst bei hohen Konzentrationen
(niedrige Affinität) miteinander interagieren.
Die Kinetik liefert Daten über die Geschwindigkeit
einer Komplexbildung und
über die Dauer der Bindung.
Fischen neuer Liganden
Proteom- und Genomforschung bringen eine
Vielzahl an bislang kaum beschriebenen Proteinen
hervor, die an bestimmten Ereignissen
beteiligt sind oder aufgrund von Homologie-
Vergleichen interessante Funktionen ausüben
könnten. Findet man die Bindepartner, so hat
man einen großen Schritt in Richtung Funktionsaufklärung
getan. Dieses Liganden-Fi-
Die Sensorgramme (Abb. 2) zeigen schon
während der Messung an, ob eine Wechselwirkung
mit dem auf dem Chip immobilisierten
Molekül stattfindet. Diese qualitative
Ja/Nein-Antwort ist zunächst ausreichend,
wenn es darum geht, Bindeaktivitäten
nachzuweisen. Für detaillierte Analysen
werden die gereinigten Interaktionsschen
kann mit der SPR-Technologie auf unterschiedliche
Weise erfolgen 7 .
Einerseits dient der Biosensor als Monitor
bei der Suche und Aufreinigung neuer Interaktionspartner.
Das zu untersuchende Protein
oder Biomolekül ist am Sensor-Chip
gebunden, über den dann die verschiedenen
Extrakte oder Kulturmedien injiziert werden.
Der Signalausschlag zeigt an, in welcher
Probe Bindeaktivität vorhanden ist. Bei
der chromatographischen Trennung testet
man auf die gleiche Weise die einzelnen
Fraktionen auf aktive Moleküle, bis man
sauberes Material für eine Sequenzanalyse
erhält.
In jüngster Zeit sind Arbeiten 8,9 publiziert
worden, in denen die Biosensor-Technologie
direkt als präparatives Hilfsmittel genutzt
wird. Dabei ist anzumerken, daß ein
Signalausschlag von 1000 Resonanz-Units
der Anlagerung von 1 ng Protein entspricht,
welches für eine nachgeschaltete Analyse im
Massenspektrometer ausreicht. Das Material,
das am immobilisierten Partner bindet, wird
eluiert und in MALDI-TOF-, NanoESI- oder
nanoESI-MS-MS analysiert 8 . In einem anderen
Ansatz wird der Sensor-Chip direkt im
MALDI-TOF zur Untersuchung der Liganden
eingesetzt 9 .
Protein-Drug-Wechselwirkungen
Viele Fragestellung in der Proteom-Forschung
zielen darauf ab, geeignete Targets zu identifizieren
(Abb. 3). Im High-Throughput-
Screening (HTS) testet man anschließend
Substanzbanken auf bindende oder inhibierende
Stoffe. Die SPR-Technologie unterstützt
den Assay-Aufbau für das HTS
durch schnelle und präzise Festlegung von
Reaktionszeiten oder Pufferbedingungen.
Das Sekundär-Screening der im HTS gefundenen
Hits ist die besondere Stärke des
Biosensors 10 . Detaillierte Bindungsdaten,
exakt kontrollierte Meßbedingungen und
kurze Analysezeiten sind die Grundlage
für effektives Nachtesten von Hits und
Optimieren von Lead-Komponenten. Im
weiteren Verlauf des Drug-Discovery Prozesses
sind „Early ADME“ (Adsorption,
Distribution, Metabolism, and Excretion)
Studien durchzuführen 11 . Aktuell kommt
es zur Verknüpfung von Biosensor-Daten
mit Chemoinformatik-Software. Erste Ergebnisse
bei Interaktionen niedermolekularer
Substanzen mit humanem Serum-Albumin
zeigten, welche chemischen Gruppen
einen positiven oder negativen Effekt
auf die HSA-Bindung ausüben 12 .
Ausblick: SPR-Array-Chips
22 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT