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BR L EI T P Z L O I CR H T
Trend
Proteomforschung:
Zellbiochemische Methoden
gewinnen an Bedeutung
MATHIAS DREGER, INSTITUT FÜR CHEMIE – BIOCHEMIE, AG NEUROCHEMIE, FREIE UNIVERSITÄT BERLIN
Die Identifizierung von Proteinen mit proteinchemischen Methoden ist durch den Einsatz immer
empfindlicherer und genauerer Massenspektrometer und der Möglichkeit eines immer höheren
Probendurchsatzes erfolgreich wie nie zuvor. Jedoch bleibt der inhaltliche Anspruch der Proteomik,
nämlich die vollständige Beschreibung der Proteinausstattung eines untersuchten Systems in dem
Zustand zum Zeitpunkt der Untersuchung, bislang eher ein ehrgeiziges Ziel. Aufgrund der Sichtbarkeit
der Leistungsgrenzen, insbesondere hinsichtlich der aktuell dominierenden Separationstechnik,
zeichnet sich ein zusätzlicher Bedarf an alternativen experimentellen Strategien in der Proteomanalyse
ab.
Die Proteomanalyse „der ersten Generation“
basiert auf drei Kerntechnologien:
Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese
werden die Proteine aufgetrennt bzw.
dargestellt. Die Trennung erfolgt mittels
isoelektrischer Fokussierung in der ersten
und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
in der zweiten Dimension (2D-
IEF/SDS-PAGE)
Die Massenspektrometrie generiert Daten ,
die für die Proteinidentifizierung benötigt
werden – und
Die Bioinformatik dient hier vor allem der
Datenbankrecherche mit massenspektrometrischen
Daten.
Ein zentrales Anliegen dieses „klassischen“
Ansatzes ist es, auch die Proteine sehr komplexer
Proben wie Gewebehomogenaten auf
großen 2D-Gelen darzustellen und proteinchemisch
– vor allem massenspektrometrisch
– identifizieren zu können. Ein Ziel ist die
Detektion bisher unbekannter Proteine, ohne
die Notwendigkeit einer vorangehenden Anreicherung.
Ein zweites besteht darin, durch
Vergleich der Proteinmuster aus Proben des
untersuchten Systems in zwei verschiedenen
physiologischen Zuständen schnell Differenzspots
zu finden – zum Beispiel korrespondierend
zu vermutlich krankheitsrelevanten
Genprodukten.
Einer der attraktivsten Aspekte einer solchen
Strategie ist es, daß extrem wenige
Vorausannahmen für die Analyse erforderlich
sind –␣ vor allem, welcher Art die Veränderungen
auf Proteinebene sein könnten.
Dazu kommt, daß die Proben bis zur zweidimensionalen
Auftrennung bei dieser Strategie
nur minimal manipuliert werden müßten.
Damit schien eine Art proteinchemisches
Screening greifbar, wie es sonst nur
aus der Molekularbiologie auf Nukleinsäureebene
bekannt war. Dem Sensitivitätsnachteil
etwa gegenüber den Differential Display-Methoden
zum mRNA-Nachweis konnte
bei einem Screening auf Proteinebene entgegengesetzt
werden, daß nur wirklich vorhandene
Proteine unter Berücksichtigung
ihrer Spleißvarianten sowie co- und posttranslationaler
Modifikationen untersucht
würden.
Mittlerweile wird zunehmend klar, daß die
Strategie, alle Proteinkomponenten eines
komplexen Systems auf einem einzigen Gel
darzustellen und zu identifizieren, beim
derzeitigen Stand der Technik nicht realisierbar
ist. Das Proteomik-Konzept wandelt
sich daher zur Zeit und wird weiterentwikkelt.
Für erfolgreichere Analysen scheint es
sinnvoll, einerseits die experimentellen Fragestellungen
stärker zu fokussieren und zu
präzisieren, andererseits eine größeres Repertoire
an Techniken zu nutzen.
Identifizierung unbekannter
eukaryontischer Proteine
Abb. 1: Struktur des
Zellkerns
Mit der zunehmend breiten Anwendung der
Proteomik-Kerntechnologie der 2D-IEF/
SDS-PAGE für unterschiedlichste Forschungsprojekte
wurden Grenzen der Leistungsfähigkeit
der Methode in ihrer derzeitigen
Form sichtbar: Zwar wird eine vergleichbare
Effizienz der Proteintrennung
durch keine andere Methode erreicht. Die
Kapazität der Gele kann jedoch nicht der
stark unterschiedlichen Menge verschiedener
Proteine gerecht werden: Seltene, vor
allem regulatorische, Proteine werden nur
unzureichend detektiert 1 . Überwiegend werden
auf Gelen, auf denen Proben aus komplexeren
eukaryontischen Geweben aufgetrennt
worden sind, vor allem Proteine des
Zytoskeletts, des Intermediärstoffwechsels,
Chaperone sowie einige mitochondriale Proteine
identifiziert. Die Listen identifizierter
Proteine aus verschiedensten Geweben oder
Organen sind häufig annähernd deckungsgleich.
Die Schlußfolgerung daraus ist, daß
sich die Analyse hier auf die Ebene einiger
Housekeeping-Proteine beschränkt. Die Detektion
bisher unbekannter Proteine scheint
zumindest bei gut untersuchten Organismen
die Ausnahme.
Ebenso ist nachteilig, daß integrale Membranproteine
unterrepräsentiert sind 2 , was umso
schwerer wiegt, da zahlreiche potentiell pharmakologisch
„interessante“, membranständige
Proteine wahrscheinlich in niedriger Kopienzahl
vorliegen. Die Ursachen für die schlechte
Darstellbarkeit integraler Membranproteine
mittels 2D-IEF/SDS-PAGE sind noch nicht
wirklich geklärt, so daß mit technischen Innovationen
vielleicht überraschende Verbesserungen
erzielt werden können.
Neuerdings gehen immer mehr Arbeitsgruppen
dazu über, subzelluläre Fraktionen anstelle
von Homogenaten zu verwenden, um
bislang unbekannte Proteine zu identifizieren.
Diesen Trend dokumentiert die Zeitschrift
ELECTROPHORESIS, die dem Thema subzelluläre
Proteome eine ganze Ausgabe widmete
3 . Als subzelluläre Fraktionen können
beispielsweise bestimmte Zellorganellen wie
Mitochondrien oder Zellkerne gewonnen
werden. Auch werden zunehmend Multiproteinkomplexe
untersucht.
|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 17