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BR L EI T P Z L O I CR H T
Gelauswertung
2D-Gel-Bildverarbeitung
für die Proteomanalyse
DR. PHIL. DR. MED. HABIL. FRIEDRICH LOTTSPEICH
MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOCHEMIE, MARTINSRIED
Die Bildverarbeitung von 2D-Gelen hat durch den immensen Aufschwung der Proteomanalyse neue
Bedeutung gewonnen. Dabei stellt sich die Bildverarbeitung als der zur Zeit größte Engpaß der
Proteomanalyse heraus. Eine große Anzahl von Gelen muß ausgewertet werden, wobei bei der
Proteomanalyse besonderer Wert auf die quantitativen Aspekte gelegt werden muß. Die quantitativen
Verhältnisse werden aber von der Probenvorbereitung, der Trennung der Proteine durch die
zweidimensionale Gelelektrophorese, der Anfärbung der Proteine, dem Scannen wie auch von den
Algorithmen der Spoterkennung und des Bildvergleiches wesentlich beeinflußt. Vor allem die
Auswerteroutinen sind trotz immer neuer verbesserter Softwareprogramme noch weit von einer
Vollautomatisierung ohne manuelle Nachbearbeitung entfernt.
Key Words: Proteomics, 2D-gel electrophoresis, staining, image analysis
Proteomics ist der quantitative Vergleich von
Proteinmustern unterschiedlicher, genau
definierter Zustände. Auf den quantitativen
Aspekt muß dabei das größte Augenmerk
geelegt werden, da im wesentlichen die Veränderungen
von Proteinen und Proteinmengen
in dem komplexen und hochdynamischen
Geschehen der biologischen Netzwerke
unterschiedliche funktionelle Zustände
charakterisieren (Abb. 1). Über eine quantitative
Analyse der Proteinveränderungen in
unterschiedlichen, genau definierten Zuständen
werden die Informationen erhalten, die
Proteomics zu einem der wesentlichen Hoffnungsträger
auf dem Gebiet der „Functional
Genomics“ machen.
Da die quantitativen Ergebnisse so wichtig
sind, muß man die wesentlichen Parameter
kennen, welche die Proteinmengen und ihre
Analyse beeinflussen.
Probenvorbereitung
Schon die Probenvorbereitung spielt hier
eine wichtige Rolle, Wie genau ist das Ausgangsmaterial
definiert, wie homogen und
wie reproduzierbar ist es herzustellen Alles
Fragen, die nur über Wiederholungen und
statistische Datenanalyse beantwortet werden
können. Das reproduzierbar hergestellte
Ausgangsmaterial muß für eine Auftrennung
der Proteine und eine Analytik vorbereitet
werden. In der Praxis ist dies wegen
der äußerst unterschiedlichen Eigenschaften
einzelner Proteine eine immens komplizierte
und schwierige Aufgabe.
Trennung
Die Auftrennung eines so komplexen Proteingemisches,
wie es ein Proteom ist, kann
nur durch Kombination verschiedener
Trenntechniken erreicht werden. Als Stand
der Technik wird heute die hochauflösende
zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese
eingesetzt, die neben einem akzeptablen
Zeitaufwand eine unübertroffene Trennleistung
für Proteine bietet. Die Qualität der
Proteinspots, die Auflösung, und auch die
Proteinmengen, die nach der 2D-Elektrophorese
im Gel zu finden sind, hängen von
vielen Parametern ab. Welches Gelsystem
wird unter welchen Bedingungen verwendet:
Ampholine, Immobiline, eingesetzte pH-
Gradienten, welche Geldimensionen, Elektrophoreseparameter
Veränderungen einzelner
Parameter haben einen gravierenden
Einfluß auf die Form und die quantitative
Abb. 1: Darstellung der
Ergebnisse einer
Proteomanalyse. Man
erkennt den quantitativen
Verlauf der Menge für
einzelne ausgewählte
Proteine in fünf
verschiedenen
Proteomzuständen.
Ausbeute einzelner Proteinspots. Als Beispiel
sind die unterschiedlichen Spotmuster
gezeigt, die man erhält, wenn dieselbe Probe
in der ersten Dimension (isoelektrische Fokussierung)
in unterschiedlichen pH-Gradienten
aufgetrennt wird (Abb. 2).
Visualisierung
Die durch 2D-Gelelektrophorese aufgetrennten
Proteine müssen im nächsten Arbeitsschritt
mit einem Farbstoff sichtbar gemacht
werden. Neben der etwas unempfindlicheren
Coomassie Blue-Färbung werden noch
häufig eine Färbung mit Silber, Zn-Imidazol
und neuerdings auch Sypro Ruby eingesetzt.
Mit Coomassie Blue können Proteinspots
mit ca. 100 ng noch gut detektiert werden,
die anderen Färbungen können auch
noch wenige Nanogramm nachweisen. Neben
der Empfindlichkeit ist aber auch noch
der dynamische Bereich wichtig – der Bereich,
in dem eine Zunahme der Proteinmenge
auch eine Zunahme der Färbeintensität
bewirkt, in dem also noch keine Sättigung
vorliegt. Hier zeigen die empfindlichen
Färbungen Silber und Zn-Imidazol einen
sehr geringen quantitative Resultate liefernden
und damit brauchbaren Bereich von
maximal 10 2 . Ganz anders die Fluoreszenz-
Färbung mit Sypro Ruby, die über mehr als
vier Zehnerpotenzen lineare Antworten liefert
und daher immer häufiger für Proteomanalysen
eingesetzt wird.
Leider haben alle Färbungen unterschiedliche
und für die einzelne Proteine ganz spezifische
und selektive Färbeintensitäten, die
eine absolute und zwischen verschiedenen
Färbungen vergleichbare Quantifizierung
verhindern. Daher liefern 2D-Gele prinzipiell
nur relative quantitative Daten, die bei
einem Wechsel der Färbung nicht oder nur
sehr aufwendig abgeglichen werden können.
Scannen
Nach der Färbung müssen die Gele quantitativ
analysiert werden, wobei in den letzten
Jahren eine ausgefeilte Bildverarbeitung für
2D-Gele entwickelt wurde. Die Information,
die in den angefärbten Gelen vorhanden ist,
muß in digitalisierter Form verarbeitet werden.
Dazu werden die Gele gescannt. Für
mit Coomassie Blue, Silber oder Zn-Imidazol
gefärbte Gele können preisgünstige Weißlichtscanner
verwendet werden, die in Dynamik
und Qualität hervorragende Bilder
liefern. Für die Analyse der mit Fluoreszenzfarbstoffen
gefärbten Gele sind allerdings
kostspielige Fluoreszenzscanner notwendig.
Hier hat man die Wahl zwischen
Geräten, die auf verschiedenen Prinzipien
beruhen. CCD-basierte Geräte nehmen um
die Auflösung zu verbessern mit einer hoch
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