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BR L EI T P Z L O I CR H T ständen unverändert, aber aufgrund von Migrationsunterschieden in den Gelen verschoben sind (Abb. 6). Die Entwicklung neuer Bioinformatik-Lösungen für die Proteomforschung, zu denen auch Bildauswerte-Programme der nächsten Generation gehören, wird eine Hauptzielsetzung in dem unter Federführung des Proteom- Zentrum Rostock neu errichteten Landesforschungsschwerpunkt Mecklenburg-Vorpommern „Genomorientierte Biotechnologie“ sein. Abb. 6: Überlagerung zweier 2D-Gele (Ampholytgele) mit unterschiedlichen Proteinexpressionsmustern aus zwei unterschiedlichen Zellkulturen. In beiden Gelen übereinstimmende Proteinspots sind durch Vektoren verbunden. Proteinspots, die nur in einem der beiden Gele erscheinen sind schwarz hervorgehoben. Abhilfe schaffen hier die seit kurzem kommerziell erhältlichen „Spot- Picking Robot“-Geräte, die sehr präzise Proteinspots bzw. deren Kern aus der Gelmatrix herausstanzen können (Abb. 5). Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von automatisierten „Spot-Picking Robot“- Systemen ist die dadurch erreichbare Reduzierung an Proteinkontaminationen (z.B. Keratine aus der Haut oder Wollkleidung), die die massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen mit hoher Nachweisempfindlichkeit, wie sie in der Proteomforschung erforderlich ist, ansonsten verhinderten. Die „Spot-Picking Robot“-Geräte der ersten Generation arbeiten zuverlässig mit Kamerasystemen, die ausreichend intensiv gefärbte Proteinspots im sichtbaren Bereich detektieren. Für die Untersuchung von fluoreszenzgefärbten Proteinspots und somit auch für die Analyse gering exprimierter Proteine wurde im Proteom-Zentrum Rostock ein Verfahren entwickelt, wodurch die Koordinaten aus den Fluoreszenzscan-Bildern per Bildanalyse-Software (vgl. Abb. 6) semi-automatisch ermittelt und dem „Spot-Picking Robot“-Gerät auf elektronischem Wege zur präzisen Exzision der Proteinspots aus dem Gel übertragen werden. Vielversprechend für die Automatisierung des „Spot-Pickings“ fluoreszenzgefärbter Proteine ist das im Endstadium der Realisierung stehende System mit integrierter Fluoreszenzdetektionsoptik der Firma Herolab (www.herolab.de), das zusammen mit dem Proteom-Zentrum Rostock im Rahmen des BMBF-Leitprojektverbundes „Proteom-Analyse des Menschen“ entwickelt und für die klinische Proteomforschung eingesetzt werden wird. Auch für die Software-unterstützte Quantifizierung von Proteinspots im Gel bietet die Fluoreszenzfärbung aufgrund des oben erwähnten hohen dynamischen Bereichs deutliche Vorteile. Die mit Fluoreszenzdetektionssystemen verbundenen höheren Anforderungen an bestehende Bildauswertungs-Programmsoftware 14 umfaßt unter anderem die Entwicklung neuer „Peak-matching“- Algorithmen, mit deren Hilfe Proteinspots aus mehreren Gelen einund desselben Proteinexpressionsmusters mit Proteinspots mehrerer Gele eines zweiten Proteinexpressionsmusters überlagert werden können. Das Ziel ist, die durch Vergleich zweier unterschiedlicher Expressionszustände in ihrer Expression veränderten Proteinspots von solchen zu unterscheiden, die in beiden Expressionszu- Ausblick Zusammenfassend kann man feststellen, daß eine Reihe von Methoden zur Präparation von Proteomen aus Geweben entwickelt wurden, die für die klinische Proteomforschung adaptierbar sind und wovon sich einige im Proteom-Zentrum Rostock bereits in der routinemäßigen Anwendung bewähren. Der Einsatz neuester Entwicklungen und Verbesserungen aus dem gerätetechnischen Bereich, etwa von neuen fluoreszenzbasierten Detektionsmethoden, erfordert jedoch die ständige Optimierung von Arbeitsprotokollen für die effiziente Präparation klinischer Proben. Die moderne Proteomforschung ist durch intensive Kooperationen zwischen sich spezialisierenden Wissenschaftsdisziplinen bestimmt und eröffnet insbesondere durch die als Schlüsseltechnologie zu verstehende massenspektrometrische Proteinstrukturanalytik einen neuen wissenschaftlichen Ansatz zur Lösung medizinisch relevanter Fragestellungen. Dabei sind umfassende Kenntnisse über Identität der an komplexen zellulären Vorgängen beteiligten Biomakromoleküle sowie über deren dreidimensionalen Strukturen von entscheidender Bedeutung. Großes Anwendungspotential besitzen daher neue chemisch-analytische, insbesondere auf der Massenspektrome |transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 11
BR L EI T P Z L O I CR H T trie basierende Methoden, die zur klinischen Praxis voll kompatibel sind und darüber hinaus hohe Nachweisempfindlichkeit, Automatisierbarkeit, „High-throughput screening“-Verfahren usw. ermöglichen sowie molekulare Informationen über Strukturen, Molekülwechselwirkungen und Struktur- / Funktionskorrelationen liefern können. Für die Weiterentwicklung der Proteomforschung wird es von zunehmender Bedeutung sein, inwieweit es ihr gelingt, sich künftig nicht nur im pharmazeutischen und diagnostizierenden, sondern auch im medizinisch-therapeutischen Kontext als eine herausragende Forschungsrichtung zu profilieren. Danksagung: Wir danken Frau K. Böttcher, Frau S. Jakobs-Emeis und Frau M. Sieb für exzellente technische Unterstützung. Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung für die finanzielle Unterstützung (FKZ 01GG9831). Literatur [1] Link, A.J. (Hrsg.), 2-D Proteome Analysis Protocols (1999), Humana Press, Totowa, New Jersey. [2] Ramsby M.L., Makowski, G.S., in: 2-D Pro-teome Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 53-66. [3] Klose, J., in: 2-D Proteome Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 67-86. [4] Hannig, K., Heidenreich, H.G. (Hrsg.), Free-flow Electrophoresis (2000), GIT Verlag, Darmstadt. [5] Ringel, B., Glocker, M.O., Weber, G., Kekow, J., Thiesen, H.-J., 4 th Siena Meeting „From Genome to Proteome“ (2000), 274-275. [6] Klose, J., in: 2-D Proteome Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 147-172. [7] Görg, A., Weiss, W., in: 2-D Proteome Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 189-196. [8] Klose, J., Humangenetik 26 (1975), 211-243. [9] Görg, A., Postel, W., Günther, S., Electrophoresis 9 (1988), 531-564. [10] Steinberg, T.H., Chernokalskaya, E., Berggren, K., Lopez, M.F., Diwu, Z., Haugland, R.P., Patton, W.F., Electrophoresis 21 (2000), 486-496. [11] Götze, L. Bantscheff, M., Arden-Jacob, J., Drexhage, K.-H., Glocker, M.O., Thiesen, H.-J. 4 th Siena Meeting „From Genome to Proteome“ (2000), 296-297. [12] Bantscheff, M., Weiss, V., Glocker, M.O. Biochemistry, 38 (1999), 11012-11020. [13] Bantscheff, M., Ringel, B., Schnabel, R., Thiesen, H.-J., Glocker, M.O., 4 th Siena Meeting „From Genome to Proteome“ (2000), 212-213. [14] Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., in: 2-D Proteome Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 363-381. Korrespondenzadresse Prof. Dr. Michael O. Glocker Proteom-Zentrum Rostock/Universität Rostock Joachim-Jungius-Str. 9, D- 18059 Rostock Tel:. 0381 - 4059 770, Fax: 0381 - 4059 686 eMail: michael.glocker@med.uni-rostock.de www.proteome-alliance.de Proteomics Massenspektrometrische Verfahren in der Proteinanalytik und der Proteomanalyse DR. MARION JÜRGENS UND DR. DETLEV SUCKAU, BRUKER DALTONIK GMBH, BREMEN Die Massenspektrometrie (MS) hat sich als zentrales Werkzeug für die Identifizierung von Proteinen und die Aufklärung der Proteinstruktur inklusive Modifikationen etabliert. Heutige Systeme tragen dabei auch den speziellen Anforderungen der Proteomforschung Rechnung und sind als Plattform für die automatisierte Hochdurchsatz-Analytik ausgelegt. Heute lassen sich eine Vielzahl analytischer Aufgaben mittels Massenspektrometrie (MS) lösen, darunter: Die vollständige Charakterisierung der Primärstruktur, einschließlich Modifikationen und Crosslinks. Die schnelle Identifizierung von Proteinen in der Proteomanalytik (Hochdurchsatz-Screening). Dazu ist die Massenspektrometrie einer 2D-Gelelektrophorese oder Chromatographie nachgeschaltet. Probenpräparation, Spektrenaufnahme und Datenauswertung erfolgen vollautomatisch. Abb. 1: Das für die Hochdurchsatz-Analytik konzipierte MALDI-TOF-Gerät autoflex ® , hier mit Roboter für automatischen Probenträgerwechsel. Die Aufklärung von Tertiärstrukturen (Faltung) und Quartärstrukturen (Protein/Protein-Interaktionen). Auch auf diesem Gebiet erweist die Massenspektrometrie in der Forschung als äußerst leistungsfähig; dies soll hier jedoch nicht weiter erörtert werden. Die wesentlichen Vorteile massenspektrometrischer Verfahren sind: Spezifität der Analysenergebnisse durch Massenbestimmung eines chemisch eindeutigen Moleküls Schnelligkeit geringe laufende Kosten, wenig Verbrauchsmaterial Empfindlichkeit bis in den sub-femtomol- Bereich Direkter Zugang auch zu N-terminal blokkierten Proteinen. Massenspektrometrische Verfahren für die Proteinanalytik MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization) und ESI (Electrospray Ionization) sind die zwei etablierten Ionisierungsverfahren zur massenspektrometrischen Untersuchung von Proteinen und deren proteolytischen Abbaugemischen (Digest). Die sich an die Ionenerzeugung anschließende Massenanalyse erfolgt im Flugzeit- (TOF und oTOF), Quadrupol- (Q), Ionenfallen- (IT) oder Fourier-Transform- (FTMS oder FT- ICR) Massenspektrometer. MALDI-TOF ist dabei die massenspektrometrische Basistechnologie für die Proteinanalytik. Hohe Massengenauigkeit, Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Automatisierung der Analyse ermöglichen ein bequemes und schnelles Probenscreening. Ein leistungsfähiges MALDI-TOF-System ist aber auch für die vertiefte Strukturuntersuchung einsetzbar: Post-Source Decay (PSD) ist eine auf dem MALDI-TOF verfügbare MS/MS-Methode, mit der aus Fragmentionen heute bereits vollautomatisch Sequenzinformationen erhalten werden können. ESI-MS ist vielseitig einsetzbar und eher für den niedrigeren Probendurchsatz geeignet. Die wesentliche Stärke resultiert aus der direkten (online-)Kopplung mit elektrophoretischen oder chromatographischen Verfah 12 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT
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