PDF Download - Laborwelt

B L I T Z L I C H T
Correlation G (τ)
Correlation G (τ)
FCS in Zellen und auf Membranen
Abb. 3: FCS-Diffusionsanalyse von farbstoffmarkierten
Molekülen in verschiedenen Zellkompartimenten.
Die charakteristische Abklingzeit der
Kurven gibt die mittlere Aufenthaltsdauer im
Fokus wieder. Die lokale molekulare Mobilität
kann mittels FCS über mehrere Größenordnungen
präzise bestimmt werden.
Abb. 2: Analyse von molekularen Wechselwirkungen
mittels FCS. Bei einfarbiger Autokorrelationsanalyse
wird die Wechselwirkung z.B.
durch die Änderung von Diffusionseigenschaften
bei Bindung an ein schwereres Molekül
nachgewiesen. Die Korrelationsfunktion
verschiebt sich zu größeren (Diffusions-)Zeiten.
Bei zweifarbiger Kreuzkorrelation ist der
Nachweis von Assoziation bzw. Dissoziation
nicht von Mobilitätsänderungen abhängig. Die
Amplitude der Korrelationsfunktion ist in
diesem Fall einfach proportional zur
Konzentration zweifarbiger (Komplex-)Moleküle.
Da die Erzeugung eines Laserfokus nichtinvasiv
ist, kann das FCS-Volumenelement
problemlos nicht nur in Lösung, sondern
auch in Zellen oder auf Zelloberflächen
(Membranen) erzeugt werden 5,6 . Dies ermöglicht
eine Analyse kleinster Mengen fluoreszenzmarkierter
oder autofluoreszenter Biomoleküle
in vivo. FCS erlaubt es, unterschiedliche
Transportprozesse (normale oder anomale
Diffusion in 2D oder 3D, aktiver Transport,
Fluß) zu unterscheiden sowie die Wechselwirkung
von Molekülen miteinander zu
untersuchen. Abbildung 3 zeigt Korrelationskurven
der Diffusion einzelner Moleküle
durch den Fokus in Abhängigkeit von der
Position in der Zelle bzw. der fluoreszenzmarkierten
Zellkompartimente. Die Abklingzeiten
der FCS-Kurven entsprechen den mittleren
Aufenthaltsdauern im Fokus und liefern
daher Information über lokale Diffusions-
oder allgemein Mobilitätskoeffizienten.
Diese Parameter können auch für kleinere
Moleküle abhängig von der Viskosität
und Topologie verschiedener Kompartimente
oder Organellen über mehrere Größenordnungen
variieren. Die intrazelluläre FCS-
Analyse erlaubt daher eine präzise Bestimmung
lokaler Viskosität, abhängig vom gewählten
Fluoreszenzfarbstoff und auch anderer
Umgebungsparameter wie pH-Wert,
Ionen- und Sauerstoffkonzentration 7 .
Zweifarbige FCS zur Analyse von
Enzymkinetiken
Durch eine Modifikation des optischen Aufbaus
läßt sich die klassische, einfarbige FCS
in ein Zweifarben-System überführen 8 . Dies
ermöglicht neben der parallelen Detektion
von spektral verschiedenen fluoreszierenden
Spezies auch einen spezifischen Signalvergleich
durch Kreuzkorrelation – und dadurch
eine sehr einfache Bestimmung der
relativen Konzentration zweifarbig fluoreszierender
Moleküle. Damit eignet sich das
Verfahren insbesondere zur Analyse der
molekularen Interaktion bzw. der Integrität
zwei- oder mehrfarbig markierter Moleküle.
Zu den biochemischen Prozessen, die mit
der Methode analysierbar sind, zählen Protein-Protein-Wechselwirkungen
(Bindung
zwischen Rezeptoren und Liganden), Protein-DNA-Interaktionen
(Bindung von Transkriptionsfaktoren
an Promotorsequenzen)
sowie enzymatisch katalysierte Spaltungsund
Verknüpfungsreaktionen. Am Beispiel
der Spaltung von DNA-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen
(Abb. 4) konnte
die Sensitivität, die Präzision und die generelle
Einsetzbarkeit der Methode erfolgreich
demonstriert werden 9-10 . Das Meßprinzip
ist analog auf alle enzymatischen
Aktivitäten anwendbar, die eine Veränderung
chemischer Bindungen zwischen fluoreszierenden
Molekülen bewirken, so etwa,
wenn mehrfach markierte Biopolymere in
die Monomere zerlegt oder unterschiedlich
markierte Monomere zum Polymer
verknüpft werden 11 .
Zweiphotonen-Anregung
Für viele Anwendungen – insbesondere in
Zellen – ist es vorteilhaft, wenn nur der
unmittelbar zum Signal beitragende Raumbereich
ausgeleuchtet wird. Aus diesem
Grund ist die im Imaging-Bereich bereits
weitverbreitete Zwei- oder Mehrphotonenanregung
auch für die FCS-Einzelmoleküldetektion
interessant 5 . Hierbei werden durch
gepulste Hochleistungslaser starke temporäre
Photonendichten erzeugt, die es erlauben,
Fluorophore mit zwei „gleichzeitig“ ankommenden
Photonen der halben Energie
(der doppelten Wellenlänge) anzuregen.
Diese Mehrphotonenanregung ist räumlich
hochselektiv, da die Intensität nur im unmittelbaren
Fokalbereich für eine Anregung
ausreicht. Dadurch entfällt der übliche Fluoreszenzlichtkegel,
und die Bestrahlungsschädigung
von Zelle und Farbstoff außerhalb
des Meßvolumens wird erheblich reduziert
(Abb. 5). Zudem erzeugt das Nah-IR-Licht,
das üblicherweise für die Zweiphotonenanregung
eingesetzt wird, weniger Hintergrund
durch Streuphänomene und hat in
vielen Medien größere Eindringtiefen. Ein
weiterer Vorteil, insbesondere für mehrfarbige
Kreuzkorrelations-Anwendungen, sind
die oft stark veränderten Zweiphotonen-Anregungsspektren
der gebräuchlichen Farbstoffe.
Bei geeigneter Auswahl ist es möglich,
mit einer einzelnen Anregungslinie
spektral separierbare Farbstoffe (z.B. grüne
und rote) gleichzeitig anzuregen 12 und das
optische System dadurch entscheidend zu
vereinfachen. Zudem verspricht diese Art
der Anregung einen alternativen Zugang
zur intrinsischen Fluoreszenz von Proteinen,
deren Absorptionsmaxima im Ultravioletten
eine Messung in herkömmlichen
optischen Systemen erschweren.
Konfokale Fluoreszenzspektroskopie
im funktionalen Screening
Neben der präzisen biochemischen Charakterisierung
molekularer Wechselwirkungen
kommt der schnellen Durchmusterung vieler
unterschiedlicher Proben zunehmend Bedeutung
zu. Ein solches funktionales molekulares
Screening wird sowohl bei der Suche
nach neuen Wirkstoffen in großen Substanzbanken
(drug screening) als auch bei der
gerichteten Evolution (directed evolution) zur
Optimierung von Biomolekülen eingesetzt.
Die Anwendung einzelmolekülbasierender
Techniken wie der konfokalen Fluoreszenzspektroskopie
stellt in diesem Gebiet den
mit Abstand effizientesten Ansatz dar. Durch
Integration der zweifarbigen Kreuzkorrelation
9 konnte diesbezüglich nicht nur eine
signifikante Steigerung der Detektionsspezifität,
sondern auch eine drastische Reduktion
der für die Bewertung der Enzymaktivi-
40 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT