Optimierung verschiedener chromatografischer Trennverfahren für ...

Fachhochschule Darmstadt Seite 8 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologieverkohlt. Dieses Verfahren ist ungeeignet für Platten deren Träger aus Kunststoff oder Metallbesteht.Des Weiteren gibt es eine Vielzahl von Nachweisreagenzien die nach entsprechenderAuftragung (z. B.: Sprühen, Tauchen) und Nachbehandlung (z. B. Erwärmung)charakteristische Färbungen für ganze Substanzklassen oder Einzelsubstanzen liefern.AuswertungsverfahrenDie folgende Abbildung zeigt die schematische Auswertung der DC-Platte. Es lassen sich fastalle Kenngrößen der Chromatografie auch auf die Dünnschichtchromatografie anwenden.Dünnschichtchromatografie- W = Substanzfleckbreite- d R = linearer Abstand zwischen Substanz zuStartlinie- d M = linearer Abstand zwischen Startlinieund LaufmittelfrontHPLCA, B = Substanzen∆z = Abstand der SubstanzfleckenAbbildung 1: Vergleich DC/HPLC-Auswertung;aus Skoog/Leary, Instrumentelle AnalytikIn der Praxis findet die Bestimmung des Retentionsfaktors, der ansonsten nur in derPapierchromatografie existiert, die größte Anwendung. Der Retentionsfaktor ist durch diefolgende Gleichung definiert:dRRF=dREr kann Werte von 1 (nicht retardierte Substanzen) und 0 annehmen. Dieser ist für eineSubstanz, in einem definierten System, charakteristisch. Unter günstigen Umständen könnendie R F -Werte bis auf zwei Nachkommastellen genau reproduziert werden. Auf den R F -Werthaben Faktoren wie Art der Platte, Probenfleckgröße, Laufmittelgemisch, Temperatur,Sättigung der Kammer und alle Randbedingungen während der Entwicklung einen Einfluss.Für die Bestimmung der Lauflänge wird bei annähernd symmetrischen Substanzflecken derMittelpunkt und bei verschmierten Flecken der Punkt mit der größten Intensität gewählt.Da in der Praxis in der Regel nur selten gleiche Bedingungen herrschen, sollte bei qualitativenBestimmungen mittels Dünnschichtchromatographie immer auf der gleichen Platte auch dieBezugssubstanz und eine Mischung aus Probe und Bezugssubstanz vermessen werden. FürAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 9 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologieeine sichere Qualifizierung muss das Experiment mit gleichem Ergebnis mit anderenParametern (Laufmittel, stationäre Phase) reproduzierbar sein.Man kann den Gehalt einer Komponente mittels Dünnschichtchromatographie halbquantitativabschätzen, indem man die Fläche eines Fleckens mit der Fläche eines Standards vergleicht.Hierfür lässt sich auch ein scannendes Densitometer verwenden um die durch Reflektion oderFluoreszenz emittierte Strahlung zu messen. Als Feldmethode lässt sich die Probe auchsolange verdünnen bis die Nachweisgrenze erreicht ist, wird mit dem Standard auf gleicheWeise verfahren, lässt sich durch die Verdünnung der Gehalt abschätzen.Bilder1. Auftragen der Start und Ziellinie2. Festlegung und Beschriftung der Startpunkte3. Kopfbeschriftung mit:-Laufmittel-Bennung der stationären Phase-Anaylsenkennzeichung/Experiment-Name/Datum4. Auftragen der Punkte durch mehrmaliges Ansetzender Kapillare auf die DC-PlatteAbbildung 2:Beschriftung einer DC- PlatteAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 10 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologie1. Die vom Lösemittel befreite, kalte Platte wirdmöglichst senkrecht in die DC-Kammer gestellt2. Der Eluent darf dabei die aufgetragenen Substanzennicht berühren3. Wenn das Fließmittel bis zur Ziellinie (ggf. kannauch vorher abgebrochen werden, dann ist dieFließmittelfront direkt zu markieren) wird die Platteaus der Kammer entfernt4. Fließmittel wird im Abzug abgedampftAbbildung 3:Entwicklung der PlatteAbbildung 4:Detektion und Auswertung1. Die Substanzflecken werden durch Betrachten imUV-Licht auf dem Fluoreszensindikator sichtbar (eskann auch jedes andere sinnvolle Detektionsverfahren,z. B. Iod-Kammer oder Sprühreagenzien,gewählt werden)2. Markierung der Positionen durch vorsichtigeBleistiftstriche3. Ausmessen der Laufwege4. Auswertung der geforderten KenngrößenAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 11 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieTrennung von cis/trans AzobenzenGeräte und MaterialienDC-KammerDC-Platte: Kieselgel 5 x 10cm auf Alufolie mit FluoreszenzindikatorLaufmittel: Mischungen aus Cyclohexan und AcetonMikroliterkapillare, graduiertProbegläschenLampetrans-AzobenzenDurchführungEs wurden einige Kristalle des trans- Azobenzen in einem Milliliter Cyclohexan gelöst. DieDC-Kammern wurden mit unterschiedlichen Mischungen des Eluenten beschickt und zurKammersättigung 30 min. im Abzug stehen gelassen. Auf die DC-Platte wurde zunächst 2 µlder Lösung aufgetragen und die DC Platte in kurzem Abstand zur Lampe für 30 Minutendirekt unter unter diese gelegt. Die Probelösung wurde im dunklen aufbewahrt. Nach Ablaufder Belichtungszeit wurde ein zweiter Punkt der Probe aufgetragen und die Platte imentsprechenden Laufmittel entwickelt. Die Auswertung erfolgte jeweils nach Detektion derSubstanzen unter UV-Licht.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 12 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieBilderAbbildung 5: Trennung von cis- und trans-Azobenzen mit einer Mischung von Cyclohexan/Aceton 8:2auf einer Kieselgel 60 DC-Platte mit FluoreszensindikatorAbbildung 6: Trennung von cis- und trans-Azobenzen mit Chloroform als Laufmittel auf einerKieselgel 60 DC-Platte mit FluoreszensindikatorChloroform wäre als isokratischer Eluent für eine HPLC-Trennung auf einer KieselgelKartusche/Säule oder eine Säulenchromatografie geeignet.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 13 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieAuswertungDie folgende Tabelle gibt die R f -Werte von cis und trans Azobenzen in Abhängigkeit vomLaufmittel wieder.Laufmittel Lauflänge tras-AzobenzenLauflänge / R fcis-AzobenzenLuflänge / R fCyclohexan : Aceton 9:1 72 mm 54 mm / 0,75 34 mm / 0,47Cyclohexan : Aceton 8:2 75 mm 57 mm / 0,76 40 mm / 0,53Cyclohexan : Aceton 7:3 72 mm 56 mm / 0,78 41 mm / 0,57Chloroform 72 mm 65 mm / 0,90 47 mm / 0,65Für den Praktikumversuch würde sich die folgende Laufmittelzusammensetzung anbieten:Cyclohexan : Aceton 8:2, aus Gründen der geringeren Giftigkeit als Chloroform.Trennung von Orangenöl-InhaltstoffenGeräte und MaterialienDC-KammerDC-Platte: Kieselgel 5 x 10 cm auf Alufolie mit FluoreszenzindikatorLaufmittel: ChloroformMikroliterkapillare, graduiertProbegläschenLimonen, Duftöl, Orangen und Orangenöl aus dem Versuch im Organischen GrundpraktikumDurchführungDas nach Ausschütteln des wässrigen Wasserdampfdestillates in Petrolether erhalteneOrangenöl wird genauso wie das Duftöl direkt aufgetragen. Die Bezugssubstanz Limonenwird in einer ca. 10%igen Verdünnung in Petrolether aufgetragen. Die Probemenge sollte ca.1 µl betragen. Nach Entwicklung in der DC Kammer erfolgt die Detektion der Substanzenzunächst im UV-Licht und anschließend in der Iod-Kammer.AuswertungDie Auswertung erfolgte durch Vergleich der beiden Proben mit der BezugssubstanzLimonen. Die folgenden Abbildungen zeigen das Ergebnis nach Betrachtung im UV-Lichtund nach der Iod-Kammer.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 14 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieAbbildung 7: Trennung von OrangenölLaufmittel Chloroform, Kieselgel 60 mit F254Probe: 2 verschiedene OrangenduftöleVergleich: Limonen (1:10 verdünnt)Für den Praktikumversuch würde sich gegebenenfalls eine semiquantitative Abschätzung desLimonengehaltes im Orangenöl durch Verdünnung bis zur Nachweisgrenze anbieten.Trennung von MöhrenfarbstoffenVorversucheZunächst wurden verschiedene Laufmittel zur Trennung der Möhrenfarbstoffe auf Kieselgel60 DC Platten ausprobiert. Hierzu wurden ca. 2 µl des Extraktes direkt auf die DC-Plattenaufgetragen und die Platte nach entsprechender Kammersättigung entwickelt.Es wurden die sichtbaren Bestandteile ausgewertet.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 15 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieErgebnisseDie folgende Tabelle gibt die Ergebnisse der einzelnen Vorversuche wieder. Es werden dieLauflängen und die Verhältnisse der sichtbaren Verbindungen angegeben.Laufmittel Lauflänge[mm]Auftrennung[mm, H=Hauptmenge, S=Schwach, SS=SehrschwachCyclohexan : Aceton 7:3 72,5 67 (H), 0 (SS)Cyclohexan : Aceton 1:1 72,5 68 (H), 0 (SS)Diethylether 72 70 (keine Trennung)Chloroform 73 70 (H), 6 (S, Iod), 0 (SS)Cyclohexan 72 15 (H), 0 (SS)Cyclohexan : 1-Propanol 8:2 72,5 67 (H), 46 (S)Acetonitril 71,5 67 (SS), 52-62 (H, verschmiert)Cyclohexan : 1-Propanol 9:1 74 66 (H), 33 (S)Cyclohexan : 1-Propanol 19:1 74 67 (H), 13 (S)Die Ergebnisse legten den Verdacht nahe, dass es sich hier um mehrere Verbindungenhandelt, die je nach Laufmittel unterschiedlich eluiert werden. Abgeleitet aus den Versuchenwurde eine zweidimensionale Chromatografie durchgeführt.Abbildung 8: Zweidimensionale EntwicklungDie DC-Platte wurde zunächst in Chloroform und anschließend um 90° gedreht inCyclohexan : 1-Propanol entwickelt.In der Iod-Kammer wurde noch eine zusätzliche Verbindung sichtbar.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 16 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieVorschrift für die zweidimensionale Trennung vonMöhrenfarbstoffenGeräte und MaterialienDC-KammerDC-Platte: Kieselgel 20 x 20 cm auf AlufolieLaufmittel: Chloroform, Cyclohexan/Aceton-GemischMikroliterkapillare, graduiertMöhrenextrakt in PetroletherDurchführungDie DC-Platte wird mit einer Schere auf ein für die vorhandene DC-Kammer geeignetes Maß(z.B. 5,5 cm x 5,5 cm bei den Runden DC-Kammern) zurecht geschnitten, so dass einezweidimensionale Entwicklung möglich ist. Hier ist es wichtig dass zumindest ein genauerrechter Winkel vorhanden ist. In diesem findet die Probenaufgabe statt. Es wird so viel Probeaufgegeben bis ein stark gefärbter Startpunkt sichtbar ist (5-8 µl des eingeengten Extraktes).Nun erfolgt die erste Entwicklung in Chloroform. Nach Abdampfen des Lösungsmittelswerden die erhaltenen Substanzflecken links und rechts mit einem dünnen Bleistiftstrichmarkiert und die Platte um 90° gedreht im zweiten Laufmittel, Cyclohexan/1-Propanol ineiner Mischung 8:2, entwickelt.AuswertungDie Auswertung erfolgte zunächst durch Markierung der optisch erkennbaren Farbfleckenund anschließend durch Entwicklung in der Iod-Kammer. Von jeder gefundener Substanzwird der R f - Wert in beiden Laufrichtungen bestimmt und gegen die Rf- Werte von Carotin(Vergleichmessung einer Carotin Kapsel) verglichen.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 17 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieTrennung von Möhrenfarbstoffendurch SäulenchromatografieEinführungDie Säulenchromatografie wird häufig zur Trennung von Substanzgemischen von ca. 100 mgbis in den Grammbereich hinein eingesetzt. Der Trennvorgang erfolgt hierbei in einem Rohr,in dem sich die stationäre Phase befindet, die von einer mobilen, flüssigen Phasedurchdrungen wird.Im Allgemeinen werden senkrecht stehende Glasrohre mit einem Verhältnis Länge zuDurchmesser von mehr als 20:1 verwendet, wobei im unteren Teil des Rohres eine Verengungmit Hahn eingearbeitet ist. Üblicherweise verwendet man als stationäre PhaseAluminiumoxide und Kieselgele, hierbei gilt die bekannte eluotrope Reihe. In neuerer Zeitfinden auch organische und modifizierte Phasen (Cellulose, Stärke und Umkehrphasen)Anwendung.Die Durchflussgeschwindigkeit wird in Abhängigkeit der Querschnittsfläche eingestellt(Faustregel: 1-5 ml/h⋅cm 2 , Richtwert kann in der Praxis bei optimalen Randbedingungen auchschneller sein).Üblicherweise werden Adsorbens und Laufmittel so gewählt, dass bei Aufreinigungs- undTrennaufgaben die unerwünschten Inhaltstoffe auf der Säule verbleiben und sich die zutrennenden Substanzen im Eluat befinden.GeräteGlassäule, ca. 40 cm lang, ca. 2-3 cm innerer DurchmesserBechergläserGlasstabKlammern und MuffenChemikalienKieselgel 60 für die SäulenchromatografieChloroform als ElutionsmittelMöhrenfarbstoffextraktPackung und Konditionierung der SäuleDie Glassäule wird entsprechend der gewünschten Füllhöhe (12-15 cm) mit trockenem,frischem Kieselgel bei geschlossenem Ablasshahn gefüllt. Anschließend wird die Säule in einbereitstehendes sauberes Becherglas entleert.Es gibt verschiedene Bauformen von Säulen, die einfachste Form ist eine leere Säule dielediglich einen Ablaufhahn enthält, in diese sind einige Raschigringe oder ein kleines StückAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 18 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologieeiner Keramikplatte zu geben um den Ablauf zu schützen. Die im Praktikum verwendeteAusführung hat nach innen zeigende Glasnasen die sich direkt über dem Ablaufhahnbefinden. Auf diese wird nun mit einem langen Metalldraht eine ca. 0,5-1 cm dickeWatteschicht (besser Glaswolle) locker positioniert und mit dem Metalldraht eineeinigermaßen gleichmäßige Oberfläche erzeugt. Darauf wird eine 1-2cm dicke Stützschichtmit Seesand aufgegeben. Bei der dritten Art der Glassäulen kann auf diese Vorbereitungenverzichtet werden, da diese eine fest eingearbeitete Glasfritte oberhalb des Ablaufhahnesenthalten.Nun wird die Säule genau senkrecht aufgehängt und ca. 2/3-3/4 mit Eluent gefüllt und dannder Eluent in das Becherglas mit dem Kieselgel einlaufen gelassen, wobei eine kleine Mengean Eluent in der Säule verbleiben sollte (Flüssigkeitsstand ca. 3cm über dem Sand). Achtung:Je nach Lösemittel kann es zur Erwärmung der Suspension kommen. Die Suspension wird mitdem Glasstab so lange kräftig gerührt bis im Becherglas keine unsuspendierte weiße Partikelmehr erkennbar sind und die Suspension eine gleichmäßige Trübung aufweist. (Bei nicht sogeeigneten Lösungsmittel kann dies nur sehr schwer möglich sein.) Nun wird die Suspensionvorsichtig an einem Glasstab in die Säule einlaufen gelassen. Der Glasstab muss am Rand derSäule anliegen, damit es zu keinem Lufteinschluss bzw. Verwirbelungen der unterenSchichten kommt. Damit sich das Packungsmaterial gleichmäßig absetzt muss die Suspensionallerdings zügig einlaufen. Wenn die Säule zu 2/3 mit der Suspension gefüllt ist, wird derAblasshahn geöffnet und langsam Eluent in eine weiteres kleines Becherglas auslaufengelassen. Achtung: das Material in der Säule darf niemals austrocknen (erkennbar an derBildung von weißen Zonen). Nun wird der die restliche Suspension nachgefüllt. Wichtig isthierbei, dass sich das in der Säule befindliche Material noch nicht vollständig abgesetzt hat,da es ansonsten zur Ausbildung von Grenzschichten kommt, die die Trennung stark stören.Ggf. kann im Becherglas verbleibendes Material mit dem erhaltenen Eluat wiederaufgeschlemmt werden. Befindet sich nun das gesamte Material in der Säule wird derAblaufhahn geschlossen und die Packung gut 10 cm (max. bis 5 cm unter den oberen Randder Säule) mit Eluent überschichtet. Die Säule wird von allen Seiten auf Unregelmäßigkeiten(Klumpen, Grenzschichten) und Lufteinschlüsse geprüft. Eventuell vorhandeneLufteinschlüsse können oft durch gleichmäßiges Klopfen (leicht!) mit einem Korkring anbeiden Seiten der Glassäule mobilisiert werden. Es ist weiterhin darauf zu achten das die obenabschließende Schicht möglichst gleichmäßig ist. Ggf. kann hier mit einem langen Glasstabvorsichtig nachgeholfen werden. Auf das Packungsmaterial wird nun eine ca. 2-3 cm starkeSchicht an Seesand als Schutz- und Konzentrierungszone aufgegeben. Dies geschieht durchlockeres Streuen des Sandes auf die Flüssigkeit (kein Schütten aus dem Gebinde, da hierbeidie obersten Schichten der Packung umgeschichtet werden können).Aufgabe der ProbeDie Kapazität einer gepackten Säule ist u. a. abhängig von ihrem Durchmesser. Es ist immerso wenig wie möglich Probenvolumen aufzugeben, um eine möglichst dünne Aufgabezone zuerreichen.Der Eluent wird so lange aus der Säule laufen gelassen bis nur noch ca. 0,5 cm derSandschicht benetzt sind (trockener Sand wird heller, die oberste Schicht der stationärenPhase darf auf keinen Fall austrocknen. Nun wird mit einer Pipette tropfenweise dieProbelösung gleichmäßig auf der gesamten Sandfläche verteilt. Bei der im Praktikumverwendeten Säule empfiehlt sich ein Probevolumen von 1-2 ml. Der gewonnene Extrakt wirdso konzentriert wie möglich verwendet. Nun wird durch vorsichtiges Öffnen desAblaufhahnes langsam die Probelösung in die stationäre Phase wandern gelassen. Wenn nurnoch wenige Millimeter der Konzentrierungszone benetzt sind, wird der AblaufhahnAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 19 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologiegeschlossen und mit einer Pipette Eluent solange tropfenweise aufgetragen, bis einigeMillimeter Lösung oberhalb des Sandes stehen. Anschließend wird wieder langsam Eluentaus der Säule tropfen gelassen. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis die überstehendeLösung farblos ist (Anmerkung: bei farblosen Lösungen wird der Vorgang fünfmalwiederholt).Trennung der ProbeDie Säule wird nun mit Eluent gefüllt und eine Tropfgeschwindigkeit von ca. 3-5 ml/mineingestellt. (Je langsamer desto besser ist die Trennung, zu langsames Laufen führt allerdingszu gesteigerten Querdiffusionen und damit zur Zonenverbreiterung.) Bei der Trennung desMöhrenfarbstoffes kann der aus der Säule austretende Eluent wieder oben auf die Säulegegeben werden, bis die erste gefärbte Fraktion auszutreten beginnt. Dieses Vorgehen ist nurdann möglich, wenn durch Vorversuche (Dünnschichtchromatografie) nachgewiesen wurdedass vor der ersten sichtbaren Fraktion keine anderen Inhaltstoffe eluieren. Sobald der erstegefärbte Tropfen aus der Säule austritt, werden Fraktionen in 5-ml-Schritten gesammelt biskein gefärbter Eluent mehr aus der Säule ausfließt. Die weiteren Fraktionen werden beidiesem Experiment nicht eluiert, sie verbleiben auf der stationären Phase und werdenentsorgt.Aufarbeitung der FraktionenDie erhaltenen Fraktionen werden mittels DC auf Einheitlichkeit geprüft und gleicheFraktionen vereinigt. Der Farbstoff wird durch Abdampfen des Eluenten gewonnen.Entleerung der SäuleDas Entfernen der stationären Phase aus der Glassäule gestaltet sich am einfachsten, wennman die Säule zunächst einfach leer laufen lässt und anschließend über Kopf aufhängt (beigeöffnetem Auslaufhahn) und ein Becherglas darunter positioniert. Nachdem das Füllmaterialvollständig durchgetrocknet ist, rutscht dieses von alleine aus der Säule heraus.Wechsel des Lösemittels/GradientenBei einem Wechsel des Lösungsmittels während der Chromatografie auf einer statischenSäule besteht die Gefahr dass es zum Aufreißen des chromatografischen Bettes kommt. Diesliegt daran, dass die einzelnen Eluenten an der stationären Phase unterschiedlicheAdsorptionskoeffizienten aufweisen. Dadurch kann es zur Erwärmung und zum Verdampfendes Eluenten an der Oberfläche kommen. Damit wird die stationäre Phase aufgerissen. Daherempfiehlt es sich immer, das Säulenbett in dem gleichen Eluenten zu packen, in dem auch dieTrennung durchgeführt werden soll.In der Literatur sind verschieden Möglichkeiten zur Ausbildung von Gradienten für dieSäulenchromatografie beschrieben. In jeden Fall muss die Verträglichkeit der Mischungen mitder stationären Phase (analog beim Eluentenwechsel) getestet werden.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 20 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieWeiterführende HinweiseSäulenchromatografische Trennungen sollten möglichst nur im Abzug durchgeführt werden.Die für statische Säulen am besten geeigneten Lösungsmittel sind halogenierteKohlenwasserstoffe, bzw. Mischungen mit solchen. Aus Umweltschutzgründen und zurArbeitssicherheit empfiehlt es sich, wenn möglich, auf weniger toxische Eluentenauszuweichen.Man kann statische Säulen auch als Flashchromatografie betreiben. Hierbei wird auf die Säuleein Vorratsgefäß für den Eluenten platziert und gefüllt. Auf das Vorratsgefäß wird mit einemAdapter durch ein Inertgas Druck ausgeübt. Achtung: Säule und das Vorratsgefäß muss gegenBersten (durch Kunststoffummantelung oder Kunststoffnetz) gesichert sein.In der industriellen Praxis ist es üblich an die Trennsäulen entsprechende Detektoren (z. B.eines normalen UV-Detektors aus der HPLC) zu koppeln und die einzelnen Fraktionen miteinem Fraktionssammler entweder zeit- oder signalgesteuert zu sammeln. Bei solchenKopplungen ist besondere Sorgfalt auf die Packung der stationären Phase zu legen, kleineUnregelmäßigen führen zu unzureichenden Trennergebnissen.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 21 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieBilder und Abbildungen der TrennaufgabeBeschreibung der Schichten von unten nach oben• Glaswolle 1-2 cm• Sandschicht (Stützschicht) 0,5-1 cm• Stationäre Phase 13 cm• Sandschicht (Konzentrierungszone) 3 cmAbbildung 9:Vollständig gepackte SäuleDie Farbstofflösung wird mehrfach mit kleinenPortionen des Eluenten auf die Säule gespült undanschließend der Sand mit einer Flüssigkeitssäule desEluenten überschichtet.Abbildung 10:Aufgetragener MöhrenfarbstoffAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 22 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieSobald die ersten gefärbten Tropfen aus der Säuleaustreten werden Fraktionen von 5-10 ml gesammeltund nach Prüfung mittels DC entsprechend vereinigtund aufbereitet.Abbildung 11:Sammlung der ersten FraktionNach Sammlung der eluierten Fraktion verbleibt derRest am Kopf der Säule. Die zweite Fraktion könntein diesem Fall oben mit der stationären Phaseabschöpft werden und mit einem stärkeremElutionsmittel herausgelöst werden. ImPraktikumversuch wird diese verworfen.Abbildung 12:Rückstand am Kopf der SäuleAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 23 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieBestimmung des Coffeingehalts in Getränkenmittels HPLCAbkürzungengGrammHPLCHigh Pressure (Performance) Liquid ChromatographyminMinutemlMilliliterµl MikroliternmNanometerppm parts per million (10 -6 )AufgabeEs ist mittels einer geeigneten HPLC- Methode der Coffeingehalt in verschiedenen Getränkenzu bestimmen.GeräteHPLC- PumpeUV-Detektor (273 nm)IntegratorHandinjektionsventil mit 20 µl ProbenschleifeInjektionsspritze 100 µlPipette, Variabel 1-1000 µlPipette, Variabel 1-10 mlMesszylinder 500 mlAnalysenwaageMesskolben 100 ml, 50 ml (2x), 25 ml (6x), 10 ml (4x)Bechergläser 25-50 ml (6x)ChemikalienCoffeinReinstwasserEluent: Methanol/Wasser 40/60MethanolAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 24 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieVorbereitung der Standards• Erstellen einer 625 ppm StammlösungEinwaage von 62,5 mg Coffein in 100 ml Messkolben und mit Reinstwasser lösen• Erstellen der verschiedenen Verdünnungeno 100 ppm4,0 ml Stammlösung in 25 ml Messkolben mit Reinstwasser auffülleno 50 ppm2,0 ml Stammlösung in 25 ml Messkolben mit Reinstwasser auffülleno 25 ppm1,0 ml Stammlösung in 25 ml Messkolben mit Reinstwasser auffülleno 10 ppm0,4 ml Stammlösung in 25 ml Messkolben mit Reinstwasser auffüllenKalibrierungNacheinander Einspritzen der einzelnen Standards, Auswertung der Flächen mit Hilfe vonExcel:Peakfläche1. Kalibrierung29.09.2004Peakfläche2. Kalibrierung30.09.2004Konzentration [ppm]10 227334 23259425 692932 69115550 1495877 1503738100 3068228 30757821. Kalibrierung3000000y = 31606,1325x - 90690,8795R 2 = 1,0000Peakfläche2000000100000000 20 40 60 80 100 120Konzentration [ppm]1. Kalibrierung Linear (1. Kalibrierung)Abbildung 13: 1. Kalibrierung zur Coffein-BestimmungAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 25 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologie2. KalibrierungPeakfläche3000000200000010000000y = 31666,6610x - 88765,8233R 2 = 0,99990 20 40 60 80 100 120Konzentration [ppm]2. Kalibrierung Linear (2. Kalibrierung)Abbildung 14: 2. Kalibrierung zur Coffein-BestimmungProbenvorbereitungDie Proben werden je nach erwartetem Coffeingehalt unterschiedlich mit Reinstwasserverdünnt und membranfiltriert. Milchhaltige Proben werden mit Methanol verdünnt,Kohlensäurehaltige Proben im Ultraschallbad entgast.VersuchsdurchführungDie verdünnten Proben werden injiziert und mittels der vom Integrator ermittelten Fläche dieKonzentration über die externe Kalibrierung berechnet.Abbildung 15: HPLC- AnlageAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 26 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieErgebnisKaffee vom MetzgerKaffee aus Mensa BistroKaffee aus Mensa AutomatEmmi Caffe Latte EspressoCoca ColaGrüner TeeRed BullKaffee BäckerNescafe CappuccinoEspresso498 ppm295 ppm609 ppm578 ppm94 ppm70 ppm317 ppm491 ppm500 ppm2072 ppmMeßmer schwarzer Tee (1 Beutel = 1,75 g):Ziehzeit 0,5 min 71 ppm1 min 136 ppm2 min 204 ppm3 min 278 ppm5 min 338 ppm10 min 368 ppmgleiche Menge Jacobs Privat Kaffee7,5 min 159 ppmAbhängigkeit des Coffeingehalts von der Ziehzeit400350Konzentration [ppm]3002502001501005000 2 4 6 8 10 12Ziehzeit [min]Meßmer Schwarzer TeeKaffeeAbbildung 16: Abhängigkeit des Coffein-Gehaltes in schwarzem Tee von der ZiehzeitAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 27 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieArbeitsvorschrift zur Bestimmung von Coffein in GetränkenVorbereitung des EluentenDer Eluent (ca. 1 Liter) wird in dem vorgegebenem Verhältnis von Methanol:Wasser 40:60durch Mischen der einzelnen Lösungsmittel hergestellt. Die Mischung wird zunächst übereinen Membranfilter (0,45 µm) filtriert und anschließend in die Vorratsflasche gegeben.Zur Filtration wird die entsprechende Absaugeinrichtung verwendet. Der Membranfilter wirdzwischen Trichter und Boden gelegt und der Trichter mittels der Klemme fixiert.Wasserstrahlpumpe aufdrehen und dann den Vakuumschlauch an die Saugflascheanschließen. Es werden zunächst nur ca. 50-100 ml Eluent zum Spülen von Trichter undSaugflasche filtriert und anschließend verworfen. Vor dem Abfüllen wird auch dieVorratsflasche mit einer kleinen Portion filtriertem Eluenten gespült.Der Eluent wird nun in der Vorratsflasche im Ultraschallbad für 5 Minuten entgast.Inbetriebnahme der HPLC-Anlage• Fluss auf 0 ml/min einstellen (Anzeige 00 im schwarzen Auswahlfeld)• Pumpe und Detektor einschalten (jeweils hinten links)• Ventil öffnen (gegen den Uhrzeigersinn) damit der Eluent ablaufen kann• Pressure Limit LOWER auf 0• Pressure Limit MAX auf 180 kg/cm² (Maximalbelastung der Säule)• Eluentenmenge im Vorratsgefäß überprüfen• Abfallgefäß prüfen, ob ausreichend Platz vorhanden ist• Pumpe mit orangem Start-/ Stop-Taster aktivieren (Leuchtdiode leuchtet, wenn aktiv)• Fluss von 1,0 ml/min wählen• Warten bis austretender Eluent gleichmäßig tropft• Ansaugleitung auf Luftblasen prüfen, warten bis keine mehr vorhanden sind)• Pumpe Fluss: 0 ml/min• Ventil im Uhrzeigersinn schließen• Pumpe in 0,1 ml/min Schritten (etwa alle 10 Sekunden) hochfahren bis zumgewünschten Fluss (1,0 ml/min)• Vor Analysenbeginn Säule ca. 15 Minuten einspülen• Einstellen der Wellenlänge am Detektor mit dem schwarzen Drehknopf (273 nm);Vorsicht: Wellenlänge während der Messung auf keinen Fall verstellen (Verfälschungder Ergebnisse)Einschalten des Integrators• Integrator einschalten (weißer Kippschalter oben rechts)• Drücken der Taste PARAM FILE• Auswahl von EDIT mit Pfeiltasten (oben rechts) und bestätigen mit ENTER• Eingabe des Datenfiles (7) und bestätigen mit ENTER (1 Sekunde kräftig drücken)• Im Display muss unter FILE 7 angezeigt werden. Wenn nicht: ausschalten und ProzedurwiederholenAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 28 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologie• Eingabe des Datums und der Uhrzeit: Drücken der Taste DATE TITLE undentsprechend im Display gefordert die Eingabe vornehmen, bestätigen mit ENTER• Eingabe von TAG NO (1) (Startwert für Analysennummer, automatisch steigend)• Eingabe des Methodennamens (COFFEIN), bestätigen mit ENTER• Integrator springt zurück ins Grundmenü• Festlegen der Datensammelrate: drücken der Taste SAMP PERIOD• Auswahl von MANUAL, mit ENTER bestätigen• Bestätigen ZEIT 00, PERIOD 200, die nächste Einstellung ZEIT 20 und PERIOD 400ebenfalls übernehmen• Exit mit ESCAPE- TasteGestaltung des AusdrucksAbbildung 17: Integrator mit Ausdruck• Drücken der Taste REPORT PLOT• Wahl von CHROMATO & DATA, mit ENTER bestätigen• Eingabe der Schreibgeschwindigkeit CHART SPD (10) in mm/min• Abschwächung des Signals PLOT ATT (8)• OFFSET (0)• BASELINE ANALYSIS auf (MARK & BASE), Einstellung für Einzeichnung vonIntegrationsgrenzen und der Basislinie• Peakbeschriftung PEAK LABEL (TIME)• Ausdrucken von allen Peaks PRINT ALL (ALL)• Zeitskala mit ausdrucken TIME SCALE PLOT (YES)• ON / OFF MARK OF TIME PROGRAM (NO)• AUTO RECALC (NO)• COMMENT AUTO PRINT (NO), Ausgabe von Kommentaren• CONC UNIT: kein Eintrag, nur Beschriftung für Berechnungsergebnisse• PRINT FORMAT (CHANGE)• Auswahl von Peaknummer NO (1), Retentionszeit RT (2), Peakfläche AR (3), PeakhöheHI (4), bestätigen mit ENTER• DATE OF HEADER (REPORT)Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 29 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieVorbereitung der Messung• Am Detektor AUTO ZERO auslösen (Leuchtdiode blinkt kurz, Signalanzeige amIntegrator schwankt um 0 ± 50 µV)• Handinjektionsventil in Stellung LOAD, 100-µl-Spritze langsam mit Standard oderProbe aufziehen, mindestens dreimal spülen• Luftblasenfrei aufziehen, vorhandene Luft durch mehrmaliges schnelles Ausstoßen derLösung und erneutes langsames Aufziehen verdrängen• Nach Aufziehen der Spritze die Kanüle von außen mit einem fusselfreiem Tuchabwischen• Spritze komplett in Injektor stecken (leichter Widerstand am Ende)• Probeschleife mit der kompletten Menge (100 µl) langsam spülen, überflüssige Lösungmuss am Abfall austreten• Spritze zurückziehenDurchführung der Messung• Gleichzeitiges Drücken der Taste 1 (START/STOP) am Integrator und schnelles Drehendes Injektionsventils im Uhrzeigersinn auf INJECT• Nach Ende des Laufs (5 min) wird die Messung durch drücken der Taste START/STOPbeendet• Das Injektionsventil schnell auf LAOD zurückstellenAbbildung 18: InjektionsventilAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 30 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieVersuche zur Kombinatorischen ChemieAufgabeIm Organischen Fortgeschrittenenpraktikum an der FH Darmstadt gibt es einenModellversuch zur Kombinatorischen Chemie. (Es werden die Aminosäuren L-Alanin (Ala)und L-Phenylalanin (Phe), deren Säuregruppen an ein polymeres Trägerharz gebundenwerden, mit Phenylisocyanat (Phen) bzw. 3-Chlorphenylisocyanat (Clphen) derivatisiert.) DerVersuch wurde im Rahmen der Diplomarbeit von Jürgen Blücher erarbeitet und mehrfach imRahmen von Fortbildungsveranstaltungen bei der Firma Provadis erfolgreich durchgeführt.Die Analyse der Produkte erfolgte dort mit Hilfe der HPLC unter Anwendung einerGraduenten-Elution. Die apparativen Gegebenheiten sind dazu an der FHD derzeit noch nichtgegeben. Deshalb sollte erprobt werden, ob nicht schon mit einer DC oder einfachen HPLCeine Analytik möglich ist, damit der Versuch für die Studierenden keinen (unbefriedigenden)Black-Box-Charakter hat.Geräte4x 5ml-Einwegspritzen mit VerschlusskappenBechergläser, verschiedene Größen4x in die Spritzen passende Frittenauf die Spritzen passende NadelnAnalysenwaageChemikalienHarz „Rink- Amide MBHA resin“ der Firma Nova- BiochemDimethylformamid, über Molekularsieb getrocknetPiperidin, 30% im DMFDichlormethn, über Molekularsieb getrocknet1-HydroxybenzotriazolFMOC-AlaninFMOC-PhenylalaninN-EthyldiisopropylaminN,N-DiisopropylcarbodiimidPhenylisocyanatChlorphenylisocyanatTriflouressigsäureAcetonitrilAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 31 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieDurchführung• Harz-EinwaageDie Spritzen werden mit einem Frittenboden versehen und dann jeweils ca. 50 mgHarz eingewogen. Anhand dieser Einwaage können alle weiteren Einwaagenberechnet werden. (Die grauen Felder sind berechnet, die hellen vorgegeben.)SpritzeEinwaageHarz [g]Beladung[mmol/g] Ala [mg] Phe [mg] Phen [µl]Clphen[µl]Ala – Phen 0,050 0,57 8,9 - 15,4 -Ala – Clphen 0,052 0,57 9,2 - - 18,1Phe – Phen 0,050 0,57 - 11,0 15,4 -Phe – Clphen 0,054 0,57 - 11,9 - 18,81- Hydroxybenzotriazol[mg]N- Ethyldiisopropylamin[µl]4,8 9,7 4,45,0 10,1 4,64,8 9,7 4,45,2 10,5 4,8N,N- Diisopropylcarbodiimid[µl]M [mg/mmol] Dichte [mg/µl]Ala 311,34Phe 387,45Phen 119,12 1,1Clphen 153,57 1,261-Hydroxybenzotriazol 135,13N-Ethyldiisopropylamin 129,25 0,76N,N-Diisopropylcarbodiimid 126,20 0,81• Quellen der HarzeIn jede Spritze werden 2-3 ml Dimethylformamid (DMF) aufgezogen. Die Spritzenwerden zehn Minuten geschüttelt, dann zwanzig Minuten stehen gelassen und nochmal kurz kräftig geschüttelt bevor die Spritzen ausgedrückt werden.• Abspaltung der Harz-SchutzgruppeIn jede Spritze wird 1 ml Piperidin- Lösung aufgezogen, die Spritzen für zehn Minutengeschüttelt und die Reaktionslösung wieder ausgedrückt.Zum Waschen werden zweimal je 3 ml DMF aufgezogen, die Spritze geschüttelt undwieder ausgedrückt. Danach werden dreimal je 2 ml Dichlormethan in die Spritzegezogen, kurz kräftig geschüttelt und ebenfalls wieder ausgedrückt.• Aktivierung und Ankopplung von Alanin bzw. PhenylalaninSeparat dazu werden in vier Schnappdeckelgläser 1-Hydroxybenzotriazol eingewogen.In zwei Gläser kommt zusätzlich das FMOC-Phenylalanin, in die beiden anderen dasFMOC-Alanin. Zusätzlich werden in jedes Gläschen 600 µl DMF und N-Ethyldiisopropylamingegeben. Die Gläschen werden im Gefrierfach auf 0 bis 3 °C abgekühltbevor N,N-Diisopropylcarbodiimid zugegeben und die Lösung in die SpritzenAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 32 von 35Fachbereich Chemie- und Biotechnologieaufgezogen wird. Die Lösung wird etwa 10 Minuten geschüttelt bevor sie wie unterAbspaltung der Harz-Schutzgruppe beschrieben gewaschen wird.• Abspaltung der Aminosäure-SchutzgruppeIn jede Spritz wird 1 ml Piperidin- Lösung aufgezogen und anschließen die Spritzen10 Minuten geschüttelt. Im Anschluss wird die Reaktionslösung ausgedrückt und wieoben beschrieben gewaschen.• Derivatisierung mit Phenyl- bzw. 3-ChlorphenylisocyanatPhenylisocyanat wird zweimal in DMF gelöst und einmal in eine Spritze mit Alaninund in eine mit Phenylalanin aufgezogen. Das Gleiche wird mit Chlorphenylisocyanatwiederholt, dann jeweils in die beiden anderen Spritzen. Die Spritzen werden wiedergeschüttelt, und dann die beladenen Harze gewaschen (s. o.).• Abspalten des TrägerharzesDie Harze werden jeweils in Schnappdeckelgläser überführt und mitTrifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wird zwei Minuten ins Ultraschallbad gestellt.Der Überstand wird entnommen und mit Acetonitril verdünnt. Diese Lösungen werdendirekt zur Analyse verwendet.• AnalytikEs wurden dünnschichtchromatografische Versuche mit HPTLC-C 8 und Kieselgel-Platten sowie eine HPLC-Analyse durchgeführt.o HPTLC:C8, Laufmittel: Acetonitril/Wasser + TFAo DC: Kieselgel, Laufmittel; Chloroform + Spur Acetono HPLC: C18, Laufmittel: Methanol/Wasser + TFAAbbildung 19: HPTLC-AnalyseAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 33 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieAbbildung 20: DC-AnalyseAriane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 34 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieZusammenfassung und AusblickDie Trennung von cis- und trans-Azobenzen konnte verbessert werden.Als weitere interessante Versuche ergäbe sich die Möglichkeit einer isokratischen HPLC-Methode zur Quantifizierung der Gleichgewichtslage über trans-Azobenzen alsBezugssubstanz. Bei der Verfolgung der Gleichgewichtseinstellung mittels HPLC inAbhängigkeit von der Belichtungszeit und der Lichtquelle (Aufgabe eines Probenanteils aufverschiedene Felder einer Tüpfelplatte und Entnahme der Probe zeitlich aus den einzelnenFeldern) müsste mit einer internen Standardmethode gearbeitet werden, umVerdünnungsfehler auszugleichen.Die Trennung der Möhrenfarbstoffe durch zweidimensionale DC gelang überraschend gutund stellt anschaulich die Lösemittelabhängigkeit des Rf-Wertes dar.Die Umstellung der Säulenchromatografie auf das Laufmittel Chloroform zeigtehervorragende Trenneigenschaften auch hinsichtlich eines möglichen Laufmittel-Recyclings.Als weitere Optionen würden sich hier die Isolierung der einzelnen Substanzflecken mittelsKreuzfraktionierung (zwei Säulen mit unterschiedlichen Laufmitteln) oder präparativer DCund anschließender Substanzidentifizierung mit Infrarotspektroskopie anbieten.Die Trennung der Orangenöl-Inhaltstoffe könnte auf einer großen DC-Platte durchgeführtwerden Sie zeigt aber auch so schon eindrucksvoll, wie synthetisches Orangenöl (Duftöl) ausvielen verschiedenen Substanzen zusammengesetzt ist.Der Aufbau der Methode zur quantitativen Coffein-Bestimmung war erfolgreich. DieMethode erwies sich als sehr robust. Eine Überprüfung mit einem Standard (Red Bull, mitCoffein-Angabe des Herstellers) zeigte eine sehr gute Wiederfindung.Als weitere Optionen würden sich bei dieser Methode die Durchführung einer Validierung (inZusammenarbeit mit dem Qualitätspraktikum) oder Versuche zur Bestimmung von Coffein inArzneimitteln anbieten.Die Versuche zur Kombinatorischen Chemie wurden zweimal durchgeführt, einmal nachStandardvorschrift und beim zweiten Mal mit (über Molekularsieb) getrockneten Lösemittelnund in dem doppelten Überschuss an Kopplungskomponenten. Es konnten keine eindeutigenchromatografischen Trennungen erzielt werden. Mit HPLC (Methanol/Wasser-Gradient undC18-Säule) und DC (Methanol/Wasser-Laufmittel und C8 HPTLC-Platte) lässt sich lediglichzwischen ClPhen- und Phen-Komponenten unterscheiden.Daraus ergeben sich die Optionen zur Methodenoptimierung (anderes Laufmittel bzw. Säule)der Trennung der Substanzen von den Nebenprodukten durch Säulenchromatografie undanschließender Charakterisierung mit IR, MS oder NMR.Unser Teil-Projekt zur Kombinatorischen Chemie wurde im Wintersemester 2004/2005 vonden Studierenden Isabelle Dorsch und Christoph Ochs sowie von Dipl.-Ing. MichaelSchröder weiter verfolgt mit folgenden Ergebnissen:• Die besten dünnschichtchromatografischen Trennungen konnten auf einer HPTLC-Platte (Kieselgel 60, Merck) mit einem Laufmittelgemisch aus 14 ml Methanol, 6 mlWasser und 0,2 ml Trifluoressigsäure oder mit einem Laufmittelgemisch aus 17 mlMethanol, 3 ml Wasser und 0,2 ml Trifluoressigsäure oder mit einemLaufmittelgemisch aus 15 ml Isopropanol und 5 ml Dichlormethan erzielt werden.Ariane Haasis, Stefan Hennen

Fachhochschule Darmstadt Seite 35 von 35Fachbereich Chemie- und BiotechnologieAllerdings konnten nicht alle vier Substanzen voneinander getrennt werden, sondernimmer nur die Derivate der Phenylisocyanate von den Derivaten der 3-Chlorphenylisocyanaten.Sinnvoll ist es, nach jedem Reaktionsschritt ein Chromatogramm aufzunehmen. Dasschemische Veränderungen stattgefunden haben, ist deutlich sichtbar.• Die DC-Ergebnisse konnten auf die HPLC (RP 18-Säule, Eluent: Methanol/Wasser17:3 bzw. 17:8) übertragen werden, mit dem gleichen – unbefriedigenden –Trennergebnis. Ein Gemisch aus zwei Produkten mit unterschiedlichen Isocyanaten istauftrennbar, wogegen die Produkte mit gleichem Isocyanat ein nahezu identischesChromatogramm aufweisen und daher nicht unterscheidbar sind. Da die einzelnenProdukte eines Isocyanates allerdings sowohl in ihrer Molmasse als auch in ihrerMolekülgröße differieren, ist es fraglich, ob das gewünschte Produkt alsHauptkomponente überhaupt hergestellt wurden und ob die Isocyanate nicht vielmehreiner Eigenreaktion unterliegen, welche die Hauptkomponente liefert. Deshalb scheintes notwendig, die Praktikumvorschrift schrittweise zu wiederholen und dabei dieeinzelnen Produkte sowie Abfälle und Waschlösungen zu untersuchen, umfestzustellen, an welcher Stelle es eventuell zu Abweichungen vom gewünschtenProdukt kommt. Des Weiteren wäre es sinnvoll, Vergleichsstoffe einzuspritzen, um zuüberprüfen, ob eine Trennung mittels isokratischer HPLC überhaupt möglich ist – wasin der Diplomarbeit von Herrn Blücher bezweifelt wurde. Sollte dies nicht der Fallsein, so ist eine HPLC mit Graduententechnik unumgänglich.Ariane Haasis, Stefan Hennen