Laboratory and Clinical Investigation内 皮 生 长 因 子 (VEGF)、 大 鼠 胰 岛 素 样 生 长 因 子 1(IGF-1)大 鼠 转 化 生 长 因 子 α(T G F-α)E L I S A 检 测 试 剂 盒 ( 凯 诺 公司 ),FITC 标 记 的 小 鼠 抗 CD45 单 克 隆 抗 体 、PE 标 记 的 小 鼠 抗CD90 单 克 隆 抗 体 。3. 方 法(1) 大 鼠 BM-MSCs 的 分 离 与 培 养完 整 提 取 Wistar 大 鼠 大 鼠 双 后 肢 ( 双 侧 胫 骨 、 股 骨 ),无 菌 条 件 下 暴 露 骨 髓 腔 。 用 含 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM/F-12 培 养基 反 复 冲 洗 骨 髓 腔 , 将 冲 出 来 的 骨 髓 收 集 于 培 养 皿 中 , 稀 释至 5m l, 置 于 37℃、 体 积 分 数 5%C O 2 细 胞 培 养 箱 内 培 养 , 此 细胞 记 为 P0 代 。 此 后 每 2-3 天 换 液 一 次 。 细 胞 长 满 瓶 底 80% 时 按1∶2 的 比 例 传 代 。(2)MSCs 细 胞 表 型 的 鉴 定取 P3 代 细 胞 , 用 P B S 配 成 细 胞 悬 液 , 细 胞 计 数 为 1×10 6 /L; 分 别 以 小 鼠 抗 C D45 单 克 隆 抗 体 和 小 鼠 抗 C D90 单 克 隆 抗 体进 行 标 记 , 流 式 细 胞 仪 进 行 检 测 。(3) 肠 道 缺 血 再 灌 注 模 型 的 制 备W i s t a r 大 鼠 适 应 性 喂 养 7d 后 进 行 试 验 。 给 予 麻 醉 、 固定 、 备 皮 , 腹 部 正 中 切 口 , 充 分 分 离 肠 系 膜 上 动 脉 , 于 血 管根 部 用 无 损 伤 血 管 夹 夹 闭 ,30m i n 后 , 后 重 新 打 开 肠 系 膜 上动 脉 , 逐 层 缝 合 腹 壁 , 给 予 禁 食 , 可 饮 水 。(4) 条 件 培 养 基 的 制 备将 肠 道 缺 血 再 灌 注 处 理 后 12h 的 大 鼠 处 死 , 距 幽 门 10c m处 将 空 肠 远 端 游 离 并 剪 取 约 20c m 肠 道 , 以 生 理 盐 水 将 肠 管 内粘 液 冲 净 , 将 肠 管 纵 向 剖 开 , 用 洁 净 载 玻 片 仔 细 刮 取 肠 道 黏膜 层 上 皮 组 织 , 称 重 , 取 0.5g 黏 膜 组 织 加 入 10m l P B S 溶 液 后匀 浆 ,1000r/m i n 离 心 10m i n, 取 上 清 液 , 用 0.22μ m 细 菌 过滤 器 将 上 清 液 过 滤 , 得 到 无 菌 的 肠 上 皮 黏 膜 的 提 取 物 。 将 提取 物 与 含 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM/F-12 培 养 基 按 照 1:4 的 比 例 混合 , 得 到 实 验 组 的 培 养 基 ; 用 同 样 的 方 法 取 正 常 W i s t a r 大鼠 的 肠 上 皮 黏 膜 无 菌 提 取 物 , 将 提 取 物 与 含 10% 胎 牛 血 清 的D M E M/F-12 培 养 基 按 照 1:4 的 比 例 混 合 , 制 成 对 照 组 的 培 养基 。以 无 菌 P B S 溶 液 与 10% 胎 牛 血 清 的 D M E M/F-12 培 养 基 按 照1:4 的 比 例 混 合 , 得 到 空 白 组 的 培 养 基 。(5) 实 验 分 组将 生 长 良 好 的 P3 代 的 B M-M S C s 分 别 接 种 至 多 孔 培 养 皿中 , 每 孔 细 胞 计 数 为 1×10 6 个 , 建 立 如 下 分 组 :1 实 验组 : 用 混 有 缺 血 再 灌 注 损 伤 肠 黏 膜 提 取 物 的 培 养 基 孵 育 B M-M S C s, 共 9 孔 ;2 对 照 组 : 用 混 有 正 常 大 鼠 肠 黏 膜 提 取 物 的培 养 基 孵 育 B M-M S C s, 共 9 孔 ;3 空 白 组 : 用 10% 胎 牛 血 清 的DMEM/F-12 培 养 基 孵 育 MSCs 共 9 孔 。 将 三 组 细 胞 置 于 37℃、 体积 分 数 5%CO 2 细 胞 培 养 箱 内 培 养 。(6) 留 取 标 本 和 指 标 检 测分 别 留 取 接 种 至 培 养 皿 之 前 的 试 验 组 、 对 照 组 、 空 白 组的 条 件 培 养 基 , 作 为 第 0 天 的 标 本 , 置 入 -20℃ 冰 箱 中 保 存待 测 , 细 胞 计 数 取 1×10 6 ;E L I S A 法 分 析 第 0 小 时 和 第 24 小 时三 组 培 养 液 中 转 化 生 长 因 子 -α(T G F-α), 血 管 内 皮 生 长 因子 (VEGF), 成 纤 维 细 胞 因 子 (FGF), 胰 岛 素 样 生 长 因 子 -1(IGF-1), 检 测 方 法 参 照 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。 将 收 集 培 养 基 后 的细 胞 立 即 消 化 并 进 行 计 数 , 将 E L I S A 检 测 结 果 以 单 位 体 积细 胞 数 量 校 正 即 为 条 件 培 养 基 中 生 长 因 子 的 浓 度 值 (n g/10 6cells)。4. 统 计 学 处 理应 用 S P S S18.0 统 计 软 件 分 析 , 计 量 资 料 以 x±s 表 示 , 采用 方 差 分 析 进 行 组 间 比 较 。P
Laboratory and Clinical Investigation图 3 BMSCs CD45 表 达 阴 性Figure 3 BMSCs CD45 presents negative图 4 BMSCs CD90 表 达 阳 性Figure 4 BMSCs presents positive3. 生 长 因 子 的 测 定 结 果检 测 各 组 条 件 培 养 基 生 长 因 子 浓 度 发 现 , 除 空 白 组 第 0 小时 培 养 基 中 生 长 因 子 浓 度 为 0 外 , 各 组 均 能 检 测 出 生 长 因 子 的存 在 。 组 内 分 析 ,BM-MSCs 培 养 24h 后 , 无 论 是 空 白 组 、 对 照组 还 是 实 验 组 , 各 组 生 长 因 子 的 浓 度 均 出 现 了 明 显 的 升 高 ,差 异 有 统 计 学 意 义 (P
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