カタログ2010-2011

抗 体 の 性 状抗 体 の 性 状4. パーオキシダーゼ 標 識 試 薬(1) パーオキシダーゼ 標 識 抗 体性 状パーオキシダーゼ 標 識 抗 体 は、クロマトグラフィーにより 精 製 されたポリクローナル 抗 体 のイムノグロブリン 分 画 やアフィニティー 精 製 された 抗 体 と、 高 い 特 異 活性 を 有 する 西 洋 ワサビのパーオキシダーゼ (HRP) から 作 製 されています。 標 識 の方 法 は、ダコ 社 で 開 発 された 特 別 な 方 法 で、Avrameas と Ternynck の 報 告 ( 文献 1)による 2 段 階 グルタールアルデヒド 法 を 基 礎 としています。その 反 応 は 非 常に 特 異 的 で、 十 分 な 量 の 結 合 と、しかも 高 い 活 性 を 有 する 標 識 抗 体 が 得 られます。得 られる 標 識 抗 体 の 分 子 量 は、およそ 20 万 から 24 万 です。特 異 性抗 体 の 特 異 性 は 交 差 免 疫 電 気 泳 動 法 により 確 認 し、 時 に ELISA 法 によっても検 討 しています。適 用パーオキシダーゼ 標 識 抗 体 は、 光 学 顕 微 鏡 や 電 子 顕 微 鏡 における 免 疫 組 織 細胞 化 学 染 色 法 , ELISA 法 , ウェスタンブロッティング 法 , 免 疫 沈 降 法 などの 方 法 に特 に 有 用 です。 希 釈 倍 率 は、それぞれの 方 法 別 に 各 施 設 で 設 定 すべきですが、 免疫 組 織 細 胞 化 学 染 色 法 では 20〜200 倍 、ELISA 法 では 500〜2,000 倍 、ウェスタンブロッティング 法 や 免 疫 沈 降 法 などの 方 法 には 100〜1,000 倍 の 希 釈 をお 勧めいたします。染 色 用 基 質 と 色 原 体光 学 顕 微 鏡 や 電 子 顕 微 鏡 における 免 疫 組 織 細 胞 化 学 染 色 法 に 3, 3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド (DAB) が 有 用 です。イミダゾールと 重 金 属 塩とを 組 み 合 わせた DAB を 使 用 することによって、 増 強 した 染 色 性 が 得 られます( 文 献 2, 3)。アガロースゲルでの 免 疫 沈 降 法 においての 最 も 感 度 の 高 い 染 色は、3 -アミノ- 9 -エチルカルバゾール (AEC) です( 文 献 5, 6)。ウエスタンブロッティング 法 にはテトラメチルベンジジン (TMB)( 文 献 4)など が 有 用 です。DAB( 文 献 7), TMB( 文 献 4), AEC はストック 溶 液 として 保 存 できる 利 点 があり、操 作 を 簡 便 化 させることができます。 過 酸 化 水 素 は 使 用 する 直 前 まで 加 えないで下 さい。なお、DAB は 発 癌 物 質 として、American National Institute for OccupationalSafety and Health により 記 載 されておりますが、 実 際 には、 非 常 に 高 いレベルでの 実 験 での 結 果 であり、オスのラットおよびマウスにおいて、4〜8g/kg の 投 与 で始 めて 影 響 が 認 められる 程 度 で、メスのラットおよびマウスにおいては 全 く 影 響が 認 められておりません( 文 献 8)。ELISA 法 においては 非 常 に 感 度 の 良 い 発 色 基 質 であるオルトフェニレンジアミン (OPD) の 使 用 が 勧 められます( 文 献 9)。DAB と OPD は 錠 剤 になったものが 発 売 されていますのでご 利 用 下 さい。さらに 高 感 度 な 発 色 を 望 む 場 合 は、テトラメチルベンジジン (TMB) の 使 用 をお 勧 めします( 文 献 10)。 調 製 不 要 の TMB 試 薬 (Code No. S1599) が 発 売 されています。溶 液安 定 剤 を 加 えた 形 で 溶 解 しています。安 定 性 及 び 保 存 法2 〜 8 ℃ で 保 存 して 下 さい。文 献1. Avrameas S. Ternynck T. Peroxidase labelled antibody and Fabconjugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry1971; 8: 1175-9.2. Trojanowski JQ. Obrocka MA, Lee VMY. A comparison of eightdifferent chromogen protocols for the demonstration of immunoreactiveneurofilaments or glial filaments in rat cerebellum using the peroxidaseantiperoxidasemethod and monoclonal antibodies. J HistochemCytochem 1983; 31: 1217-23.3. S c o p s i L . L a r s s o n L I . I n c re a s e d s e n s i t i v i t y i n p e rox i d a s eimmunocytochemistry. A comparative study of a number of peroxidasevisualization methods employing a model system. Histochemistry 1986;84: 221-30.4. McKimm-Breschkin JL. The use of tetramethylbenzidine for solid phaseimmunoassays. J Immunol Methods 1990;135:277-80.5. Graham RC. Lundholm U. Karnovsky MJ. Cytochemical demonstrationof peroxidase activity with 3-amino-9-ethylcarbazole. J. HistochemCytochem 1965; 13: 150-2.6. Broe MK, Ingild A. Amplification of immunoprecipitates in agarose gelsby horseradish peroxidase-labelled antibody. Scand J Immunol 1983;17: 255-8.7. Pelliniemi LJ, Dym M, Karnovsky MJ. Peroxidase histochemistry usingdiaminobenzidine tetrahydrochloride stored as a frozen solution. JHistochem Cytochem 1980; 28: 191-2.8. Weisburger EK, Russfield AB. Homburger F, et al. Testing of twenty-oneenvironmental aromatic amines or derivatives for long-term toxicity orcarcinogenicity. J Environ Pathol Toxicol 1978; 2: 325-56.9. Sørensen CH. Secretory IgA enzyme immunoassay. Application of amodel for computation of the standard curve. Scand J Clin Lab Invest1982; 42; 577-83.10. Bos, E.S., van der Doelen, A.A., Lan Rooy N., Schuurs, A.H.W.M. 3,3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen forhorseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J. Immunoassay 2 :187-204 (1981)(2) パーオキシダーゼ 標 識 ストレプトアビジン性 状パーオキシダーゼ 標 識 ストレプトアビジンは Streptomyces avidinii から 精 製したストレプトアビジンに 高 い 特 異 活 性 を 有 する 西 洋 ワサビのパーオキシダーゼ(HRP) を Avrameas と Ternynck の 報 告 による 2 段 階 グルタルアルデヒド 法 を改 良 したダコ 社 独 自 の 方 法 により 結 合 し、 精 製 しています。適 用パーオキシダーゼ 標 識 ストレプトアビジンは 免 疫 組 織 細 胞 化 学 染 色 法 , ウェスタンブロッティング 法 , ELISA 法 , 核 酸 プローブを 使 った in situ hybridization 法など 各 種 の 方 法 での 高 感 度 な 検 出 に 適 しています。溶 液15mmol/L アジ 化 ナトリウムを 含 む TBS (pH 7.2) に 溶 解 されています。保 存 法2 〜 8 ℃ で 保 存 して 下 さい。(3) パーオキシダーゼ 標 識 StreptABComplex性 状パーオキシダーゼ 標 識 StreptABComplex はストレプトアビジンとパーオキシダーゼ 標 識 ビオチンの 複 合 体 (Complex) で、 複 合 体 を 形 成 するストレプトアビジンの 量 とパーオキシダーゼ 標 識 ビオチンの 量 の 比 率 は、ビオチン 標 識 抗 体 との 機能 的 な 結 合 部 位 が 十 分 に 残 存 するように 厳 密 に 検 討 されています。適 用パーオキシダーゼ 標 識 StreptABComplex は 免 疫 組 織 細 胞 化 学 染 色 法 , ウェスタンブロッティング 法 , ELISA 法 , 核 酸 プローブを 使 った in situ Hybridization 法など 各 種 の 方 法 での 高 感 度 な 検 出 に 適 しています。溶 液15mmol/L アジ 化 ナトリウムを 含 む PBS (pH 7.2) に 溶 解 しています。保 存 法2 〜 8 ℃ で 保 存 して 下 さい。(4) PAP 複 合 体性 状PAP 複 合 体 は 高 い 反 応 性 を 示 し、 光 学 顕 微 鏡 をはじめ 電 子 顕 微 鏡 を 使 用 した広 範 な 免 疫 組 織 細 胞 化 学 染 色 法 に 利 用 できます。溶 液15mmol/L アジ 化 ナトリウムを 含 む 酢 酸 緩 衝 液 (pH 6.6) に 溶 解 しています。保 存 法2 〜 8 ℃で 保 存 して 下 さい。参 考 文 献Taylor CR, An immunohistological study of follicular lymphoma, reticulumcell sarcoma and Hodgkin′s disease. Europ J Cancer 1976; 12: 61-75.130i : 体 外 診 断 用 医 薬 品 。 体 外 診 断 用 医 薬 品 名 につきましては (11) ページをご 参 照 ください。d : 医 薬 用 外 毒 物g : 医 薬 用 外 劇 物