Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
6<br />
DNA Replikasyon Kinetiği Analizi<br />
• • • •<br />
Cenk KIĞ<br />
Bölünen hücrelerin canlılıklarını sürdürebilmeleri için genetik bilginin yeni (yavru) hücrelere hatasız biçimde<br />
aktarılması gereklidir. Ayrıca, DNA molekülünün replikasyonu sırasında meydana gelen hataların çeşitli kalıtsal<br />
hastalıklara <strong>ve</strong> kanserleşmeye de neden olabildiği bilinmektedir. Bu tip hataların önlenmesi, kontrol <strong>ve</strong> onarım<br />
mekanizmalarının yanında replikasyon çatalının devamlılığının sağlanması (stabilitesi), çatalın optimal bir hızda<br />
ilerlemesi, başlangıç noktalarında (orijin) replikasyonun düzenli bir şekilde başlaması <strong>ve</strong> ilerlemenin başlangıç<br />
noktasına göre zıt yönde eş zamanlı <strong>ve</strong> simetrik bir şekilde meydana gelmesi gibi çeşitli faktörlerin (replikasyon<br />
dinamiği <strong>ve</strong>ya kinetiği) de sürdürülebilirliğini gerektirir.<br />
DNA replikasyon kinetiğinin nicel analizi amacıyla kullanılan doğrudan yöntemlerin başında DNA moleküllerinin<br />
cam yüzeylere bağlanıp iplikçikler halinde gerilerek incelenmesi gelir (Herrick <strong>ve</strong> Bensimon, 1999). Bu yöntemle<br />
replikasyon birimleri DNA iplikçikleri halinde ayrı ayrı incelenebilmektedir. Son yıllarda, aktif replikasyon çatallarının<br />
hareket yönü <strong>ve</strong> hızı gibi çeşitli değişkenlerin doğrudan <strong>ve</strong> kantitatif analizine olanak <strong>ve</strong>ren floresans mikroskopisi<br />
(bkz. 1.2.13) temeline dayalı daha basit <strong>ve</strong> ekonomik bir yöntem Schwab <strong>ve</strong> Niedzwiedz (2011) tarafından uyarlanarak<br />
geliştirilmiştir. Yöntemin ilk aşamasında, halojen bağlı nükleotid analoglarının (CldU, IdU, BrdU vb.) besi ortamına<br />
eklenerek replikasyon geçiren hücrelerde in vivo yeni sentezlenen DNA molekülünün yapısına katılmalarına<br />
yol açılır (Şekil 6.1a <strong>ve</strong> b). Ardından, parçalanan hücrelerden serbest kalan DNA moleküllerinin bir lam üzerinde<br />
x dk. x dk. y dk.<br />
(a)<br />
(b)<br />
Şekil 6.1. Yeni sentezlenen DNA ipliğinin IdU <strong>ve</strong> CldU molekülleriyle işaretlenmesi (Schwab <strong>ve</strong> Niedzwiedz’den. URL:http://www.<br />
jo<strong>ve</strong>.oCm/video/3255 internet adresinden de sürece ilişkin animasyona ulaşılabilir). (a) Birincil işaretleme: Kültür ortamına eklenen IdU<br />
molekülünün belli bir süre (x dakika) yeni sentezlenen DNA ipliğinin yapısına katılması; İkincil işaretleme: Kültür ortamına (CldU’ya göre<br />
10 kat daha derişik biçimde <strong>ve</strong> kesintisiz olarak) eklenen IdU molekülünün yeni sentezlenen DNA ipliğinin yapısına katılması (kesintisiz<br />
<strong>ve</strong> eşit sürelerde inkübasyonun sağlanabilmesi için arada yıkama yapılmamalıdır), (b) özgül birincil antikorlarla CldU <strong>ve</strong> IdU işaretlemesi<br />
yapıldıktan sonra farklı renklerde floresan işaret taşıyan ikincil antikorlar (CldU için kırmızı <strong>ve</strong> IdU için yeşil) uygulanarak, konfokal<br />
mikroskopla bu moleküllerin yapıya katıldığı iplik kesintisiz olarak kırmızı <strong>ve</strong> yeşil bir çubuk şeklinde görüntülenebilir.<br />
93
Change language