Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
21.B<br />
Schizosaccharomyces pombe’de aft1 Geninin Göreceli<br />
Anlatım Analizi<br />
Bedia PALABIYIK<br />
Çalışmada SBYR Green temeline dayalı gerçek zamanlı PCR (qPCR) yöntemi uygulanarak hedef genin (atf1) referans<br />
gene (aktin proteinini şifreleyen act1) göre göreceli anlatım düzeyleri incelenmiştir (“relati<strong>ve</strong> quantification”). Buna<br />
göre uygulama, kontrol (YT_K) <strong>ve</strong> deney (YT_D) grupları olmak üzere iki örnek üzerinde kurgulanmıştır.<br />
Materyal<br />
Schizosaccharomyces pombe, yabani tip (972h - )<br />
Gerekli Malzeme <strong>ve</strong> Donanım<br />
Stratagene Mx-Pro-Mx3005P qPCR sistemi<br />
“SYBR Green PCR Master Mix” (Roche)<br />
Özgül ileri <strong>ve</strong> geri primerler (Araştırıcı tarafından tasarlanır)<br />
96-kuyucuklu tabla<br />
Tablayı örten yapışkanlı şeffaf kap<br />
Buz bloğu (Bütün çözelti <strong>ve</strong> örnekleri soğuk tutmak için)<br />
Yöntem<br />
Örnek Hazırlama<br />
Çalışmada kullanılacak RNA örneklerinin kalitesi analizin gü<strong>ve</strong>nilirliği bakımından çok önemlidir. Her örnek üç<br />
tekrarlı olmalıdır. Bu tekrarlar programın <strong>ve</strong>ri analizi için gereklidir.<br />
1. Hedef <strong>ve</strong> referans genlere ait primerlerin tasarımı “Primer3” programı kullanılarak tasarlanır (Tablo 1).<br />
Tablo 1. Çalışmada kullanılan primerler<br />
Gen adı Primerin adı Primer dizileri<br />
atf1<br />
atf1L (ileri) 5´-ACCCCTACTGGAGCTGGATT-3´<br />
atf1R (geri) 5´-ACCATCCCTTGGGGTAAAAC-3´<br />
act1<br />
act1L (ileri) 5´-AGATTCTCATGGAGCGTGGT-3´<br />
act1R (geri) 5´-TCAAAGTCCAAAGCGACGTA-3´<br />
2. Her primer serisi için kaç reaksiyonun yapılacağı hesaplanır. Tablo 2’de <strong>ve</strong>rilen reaksiyon programı uygulanır.<br />
Tablo 2. Deney tablasının düzenlenmesi.<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11* 12*<br />
A S1<br />
1<br />
act1<br />
S2<br />
5<br />
act1<br />
S3<br />
25<br />
act1<br />
S4<br />
125<br />
act1<br />
YT_K<br />
act1<br />
YT_K<br />
act1<br />
YT_K<br />
act1<br />
YT_K<br />
atf1<br />
YT_K<br />
atf1<br />
YT_K<br />
atf1<br />
B S1<br />
1<br />
S2<br />
5<br />
S3<br />
25<br />
S4<br />
125<br />
YT_D<br />
act1<br />
YT_D<br />
act1<br />
YT_D<br />
act1<br />
YT_D<br />
atf1<br />
YT_D<br />
atf1<br />
YT_D<br />
atf1<br />
C<br />
S1<br />
1<br />
S2<br />
5<br />
S3<br />
25<br />
S4<br />
125<br />
NTC<br />
act1<br />
NTC<br />
act1<br />
NTC<br />
act1<br />
D<br />
E<br />
F<br />
G<br />
H<br />
* Kullanılan tabla 96 kuyucuklu olduğundan tasarlanan deneyde bu kuyucuklar boştur.<br />
NTC<br />
atf1<br />
NTC<br />
atf1<br />
NTC<br />
atf1<br />
425
Change language