Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
21<br />
Gerçek Zamanlı Polimeraz<br />
Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile<br />
Gen Anlatımının Analizi<br />
• • • •<br />
Filiz GÜREL<br />
Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ya da diğer adıyla kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)<br />
başta gen anlatımının belirlenmesi <strong>ve</strong> patojenlerin tanısı olmak üzere çeşitli DNA analizlerinde kullanılan duyarlı<br />
<strong>ve</strong> güçlü bir yöntemdir. <strong>Temel</strong>inde PCR’ye dayanan bu yöntem floresan teknolojisindeki ilerlemelere bağlı olarak<br />
1990’lı yıllarda geliştirilmiştir. Bu yöntemde oluştukları andan itibaren PCR ürünlerindeki artış, DNA’ya bağlanan<br />
floresan boyalar sayesinde izlenebilmekte <strong>ve</strong> eşzamanlı olarak ölçülebilmektedir. Ek olarak, oluşan ürünler yüksek<br />
sıcaklığa <strong>ve</strong> devamında erimeye bırakılarak uzunlukları <strong>ve</strong> nükleotid içeriklerine bağlı olarak daha ayrıntılı bir şekilde<br />
tanımlanabilmektedir. Bu son uygulama günümüzde tek nokta polimorfizmlerinin duyarlı şekilde saptanmasına<br />
olanak <strong>ve</strong>rir. Bu özellikleriyle qPCR moleküler biyoloji araştırmalarında gen analizlerinin <strong>ve</strong> klinik mikrobiyolojide<br />
tanının kalitesini artırmıştır.<br />
PCR’nin gerçek zamanlı olarak (anında) izlenebilmesi ilk kez 1992’de Roche <strong>Moleküler</strong> Sistemler şirketinden Russell<br />
Higuchi <strong>ve</strong> grubu tarafından başarılmıştır. Bu çalışmada PCR’nin her döngüsünde DNA’ya bağlanan etidyum<br />
bromürün yaydığı floresandaki artış bir video kamera ile saptanmıştır. Zaman içerisinde, oluşan ürün miktarının<br />
doğrudan ölçülebilmesine olanak <strong>ve</strong>ren aletler tasarlanmıştır. Günümüzde qPCR için boyut olarak küçülmüş, çok<br />
sayıda örnekle çalışılabilen <strong>ve</strong> analiz süreleri kısalmış aletler bulunmaktadır.<br />
Gerçek zamanlı PCR’nin klasik PCR <strong>ve</strong> gen anlatımı analizlerinde kullanılan diğer yöntemlere göre oldukça önemli<br />
avantajları vardır. Hedef bölgenin çoğaltımı <strong>ve</strong> kantitasyonu aynı alette yapılabilmekte, böylece elektroforez aşaması<br />
ortadan kalkmaktadır. Bu da çok örnekli çalışmalarda zaman tasarrufu sağladığı gibi bulaşma (kontaminasyon)<br />
tehlikesini de azaltmaktadır. Nükleik asit özütlemesi gibi ön aşamaların tamamen otomatik hale gelmesiyle birlikte,<br />
qPCR’ye dayalı tanı <strong>ve</strong> analizlerin süresi son derece kısalmıştır.<br />
Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonunun en fazla kullanıldığı çalışma alanı hiç şüphesiz gen anlatımının<br />
analizidir. Canlılığın devamı, bölünme <strong>ve</strong> farklılaşma gibi birçok hücresel süreç gen anlatımının değişmesiyle<br />
gerçekleştiğinden, özel genlerin transkripsiyon düzeylerinin nicel olarak ortaya konulabilmesi genin işlevine<br />
ilişkin çok önemli bilgiler sunar. qPCR ile hücrede bir gene ait hedeflenen mRNA’nın miktarı yüksek duyarlılıkta<br />
belirlenebilir. Transkripsiyon ürünü RNA miktarının belirlenmesinde kullanılan diğer başlıca yöntemler Northern<br />
damgalama (blotlama) (bkz. 12.4), RNaz koruma belirlemesi <strong>ve</strong> geri transkripsiyon PCR’si (bkz. 16.5.3) olmuştur.<br />
Northern damgalamanın en büyük zorluğu mRNA’nın hücrelerden çok az miktarda elde edilebilmesidir. PCR’ye<br />
dayalı bir yöntem olan qPCR ise bu moleküllerin dolaylı çoğaltımını sağlayarak hem bu zorluğun aşılmasını hem<br />
399
Change language