Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
10<br />
Nükleik Asitlerin Analizi<br />
• • • •<br />
Ayşegül TOPAL SARIKAYA<br />
Nükleik asitlerin nanogram <strong>ve</strong>ya mikrogram düzeyindeki miktarlarının belirlenmesi, moleküler biyoloji alanında<br />
çalışan araştırıcılar için temel noktalardan biridir. Genellikle izole edilen kromozomal <strong>ve</strong>/<strong>ve</strong>ya kromozom dışı<br />
DNA’ların <strong>ve</strong> sitoplazmik <strong>ve</strong>ya organellere ait RNA’ların miktar tayininde absorbsiyon (soğurma) temeline<br />
dayanan spektrofotometrik yöntemler (bkz. 1.2.9) kullanılır. Nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde <strong>ve</strong>ya<br />
özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki DNA<br />
parçalarının saptanmasında ise elektroforetik yöntemlerden (bkz. 1.2.8) yararlanılır.<br />
10.1. Spektral Analiz<br />
Başlangıçta UV temelli olarak yapılan spektrofotometrik analizlere floresan boyaların kullanımıyla gerçekleştirilen<br />
floresansa dayalı spektroflorometrik analiz yöntemleri de eklenmiştir.<br />
10.1.1. UV-Spektrofotometrik Yöntem<br />
Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm dalga boyunda maksimum absorbsiyon özelliği gösterir. Bu nedenle<br />
260 nm’de ölçülen absorbans değerleri (A 260<br />
) oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin mikrogram düzeyinde<br />
miktarlarının belirlenmesinde kullanılır.<br />
1 optik yoğunluk (OD) çift iplikli DNA için 50 µg/mL, tek iplikli DNA için 33 µg/mL, RNA için 40 µg/mL <strong>ve</strong><br />
oligonükleotidler için 20-30 µg/mL’ye karşılık gelmektedir. Buna göre nükleik asitler için miktar belirlenmesinde<br />
aşağıdaki formül kullanılır.<br />
DNA (RNA) (µg/mL) = A 260<br />
x sulandırım oranı x 50 (40)<br />
A 260<br />
’daki değerler DNA <strong>ve</strong> RNA’yı birbirinden tam olarak ayırt etmeye yetmez. Bununla beraber 260 <strong>ve</strong> 280 nm dalga<br />
boylarında okunan değerler arasındaki oran nükleik asitlerin saflığı hakkında bilgi <strong>ve</strong>rmektedir. Bunun yanı sıra<br />
proteinler de 280 nm’de absorbsiyon özelliği gösterirler, bu nedenle 280 nm de ölçülen bir değerdeki artış A 260<br />
/A 280<br />
oranında düşmeye neden olur. Saflaştırılmış DNA’da A 260<br />
/A 280<br />
oranı yaklaşık 1.75-1.8’in üzerinde olmalıdır. 325 nm’de<br />
ölçülen değer DNA çözeltisinde partikül bulunduğunu <strong>ve</strong>ya ölçümde kullanılan kü<strong>ve</strong>tin kirli olduğunu; 230 nm’deki<br />
değer ise nükleik asit çözeltisinde peptidlerin (özellikle aromatik halka taşıyanların) <strong>ve</strong>ya fenolün bulunduğunu<br />
gösterir. Ölçümlerde UV geçirgen kuvartz kü<strong>ve</strong>t kullanılmalıdır. Cam <strong>ve</strong>ya plastik kü<strong>ve</strong>tler kullanılamaz. Ayrıca tek<br />
iplikli DNA, RNA, PCR primerleri <strong>ve</strong> dNTP’ler ya da fenol gibi aromatik bileşikler kullanılan dalga boyu aralığında ışık<br />
emilimini etkileyebilirler. Bu nedenle bazı durumlarda DNA analizi spektrofotometrik yöntemlerle zor olabilir.<br />
Son yıllarda DNA derişimi <strong>ve</strong> saflığı çok küçük hacimlerde (1µL) ölçüm yapabilen özel spektrofotometreler aracılığıyla<br />
yapılabilmektedir. Bu aletlerle yapılan analiz de diğer spektrofotometrelerde olduğu gibi 260 nm’de ölçülen<br />
absorbsiyon değerlerine dayanır (bkz 1.2.9).<br />
127
Change language