Temel ve İleri Moleküler Biyoloji Yöntemleri Genomik ve Proteomik Analizler

8
Total RNA ve mRNA İzolasyonu
• • • •
Ayşegül TOPAL SARIKAYA
Hücrelerdeki total RNA’nın bakterilerde toplam hücre ağırlığının %6’sını, gelişmiş yapılı canlılarda ise %1.1 kadarını
kapsadığı bilinmektedir (bkz. Tablo 1.1). Örneğin, tipik bir memeli hücresi yaklaşık 10-15 µg total RNA içerir. Bu
miktarın %80-85’i rRNA’ya (28S, 18S ve 5S rRNA) aittir. Kalan %15-20’lik miktar ise molekül ağırlığı düşük RNA türlerini
(tRNA, nükleusa ait küçük RNA’lar) içermektedir. mRNA ise total RNA’nın %1-5’ni kapsayan, boyutları ve dizisi birkaç
yüz bazdan birkaç kilo baza kadar değişen bir heterojenlik göstermektedir. Parçalanmamış ve temiz RNA izolasyonu,
klonlama ve gen anlatımı analizi çalışmalarında oldukça önemli aşamalardan biridir. Herhangi bir hücre tipinden
izole edilen total RNA’dan mRNA’nın izolasyonu ve bu işlemi takiben çift iplikli DNA (“complementary DNA”, cDNA)
elde etmek de mümkündür. Böylece istenen dokudan cDNA kitaplığı oluşturulabilir ve istenen gen klonlanabilir
(bkz. 15.15). Ayrıca, araştırılan genin transkripsiyon düzeyinde düzenlenme mekanizması incelenebilir.
RNA çalışmalarının tümünde başlıca ön koşul yapısını koruyan parçalanmamış RNA’nın izolasyonudur. İzolasyon
sırasında en fazla karşılaşılan sorun, aktivitesini uzun süre koruyan, ribonükleaz (RNaz) enziminin bulunuşudur.
Çok az miktarlarda RNaz’ın varlığı bile RNA’nın bütün olarak elde edilmesini engelleyebilmektedir. Bu sorundan
kurtulmak için tüm çözeltiler, cam ve plastik eşyalar özel yöntemlerle hazırlanmalı ve steril edilmelidir. RNaz
özellikle çalışanın ellerinden bulaştığı için RNA izolasyonu sırasında kesinlikle eldiven giyilmelidir. Kirli cam eşya
veya yüzeylerle temas edilmişse eldivenler değiştirilmelidir. İzolasyonda kullanılacak çözeltiler RNaz’ın aktivitesini
yok eden dietilpirokarbonat (DEPC) ile hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, Tris, DEPC’nin aktivitesini yok ettiği için Tris
içeren çözeltiler DEPC ile hazırlanmamalıdır. Çözelti hazırlanmasında kullanılan tüm kimyasalları mümkünse sadece
RNA çalışmalarına ayırmak en kesin yoldur. Tartımlarda daha önce elle tutulmuş spatül gibi araçların kimyasalların
içine sokulması bile RNaz kirliliğine yol açacağından, bunların cam eşyalar gibi fırında steril edilmesi gerekir. Cam
eşyalar 180°C’da 8 saat veya 300°C’da 4 saat tutularak, ya da kloroform ile yıkanarak RNaz’ın aktivitesinin yok edilmesi
sağlanabilir. Bazı cam eşyalar, içinde %0.1 oranında çözünmüş DEPC bulunan su ile doldurularak 2 saat 37°C’da
bekletilir. Daha sonra birkaç kez steril saf su ile yıkanır ve 15 dakika otoklavlanır. Bu işlem DEPC’nin uzaklaştırılması
için gereklidir. Bu şekilde RNA’nın pürin bazlarının karbon atomlarının metillenmesi önlenir. Karboksimetillenme
DNA/RNA veya RNA/RNA melezlerinin oluşumunu çok olumsuz etkilemez, fakat karboksimetillenmiş RNA düşük
düzeyde anlatım yapar.
Steril ve tek kullanımlık plastik eşyalar RNaz içermediklerinden RNA izolasyonu ve saklanması aşamalarında herhangi
bir hazırlık gerektirmeden kullanılabilirler. Ancak bu malzemeleri de eldivenle tutmak gerekir. Elektroforez tanklarının
da yukarıda açıklandığı gibi DEPC içeren suyla yıkanması önerilmektedir. Bununla beraber bazı araştırmacılar, DEPC
ile işlem görmüş hiçbir malzemeye gerek olmadığını, RNaz aktivitesinin yok edilmesi için, DEPC yerine %30’luk H 2
O 2
ile yaklaşık 30 saniye yıkama ve birkaç kez saf su ile durulamadan sonra 180°C’da 6 saat tutmanın yeterli olacağını
ileri sürmektedirler.
RNA izolasyonu protokollerinin tümünde ilk aşama hücre çeperinin ve zarının parçalanmasıdır (lizis). Daha sonra
hücre lizatının santrifüjlenmesi ile RNA diğer hücresel makromoleküllerden ayrılır. RNA izolasyonu yönteminin
113